本文關(guān)鍵詞：哺乳動物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫構(gòu)建及靶向ErbB3 ScFv篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗體藥物是目前研究和應(yīng)用最為廣泛的一類生物技術(shù)藥物，是腫瘤、感染、炎癥等疾病的重要治療手段。全人源抗體藥物因其免疫原性低，在迄今美國食品藥品監(jiān)督管理局（American Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)上市的抗體類藥物中（僅指含抗體可變區(qū)的抗體藥物）占有很大的比重，已成為未來臨床應(yīng)用抗體發(fā)展的趨勢。目前，全人源抗體候選序列主要通過噬菌體展示文庫篩選獲得，再改構(gòu)到哺乳動物細(xì)胞中進行大量生產(chǎn)表達，這使“萬里挑一”獲得的抗體在從原核到真核的過程中面臨很大的親和力改變等風(fēng)險。相比之下，基于哺乳動物細(xì)胞抗體庫篩選出的候選抗體將原核表達系統(tǒng)篩選抗體具備的風(fēng)險和弊端大大降低。目前，哺乳動物細(xì)胞抗體庫技術(shù)報道有限，在國內(nèi)外仍處于起步階段，具有很大的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價值。本研究擬構(gòu)建真核哺乳動物細(xì)胞展示型單鏈抗體（single—chain antibody fragment，ScFv）庫，并選取表皮生長因子受體-3（v-erb-b2avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog3，ErbB3）為靶點進行ScFv抗體篩選以驗證本抗體庫的有效性。 第一部分構(gòu)建真核哺乳動物細(xì)胞展示型ScFv抗體庫。 本研究首先收集包括多種病種及健康志愿者在內(nèi)共120例志愿者外周血淋巴細(xì)胞，通過提取總核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）并反轉(zhuǎn)錄獲得互補脫氧核糖核苷酸（complementary Deoxyribonucleic acid，cDNA），作為擴增人抗體庫可變區(qū)基因的模板。參照文獻設(shè)計28對簡并引物擴增重鏈可變區(qū)，設(shè)計16對簡并引物擴增輕鏈可變區(qū)。利用上述引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction,PCR）擴增、膠回收分別獲得重鏈抗體可變區(qū)（Heavy-chain variable region, VH）和輕鏈抗體可變區(qū)（Light-chain variable region,VL）庫。通過重疊PCR，以(G4S)3的linker將VH及VL連接成單鏈抗體ScFv。通過Sfi I及Sal I雙酶切位點將ScFv連接至載體pDisplay，構(gòu)建重組質(zhì)粒庫pDisplay-ScFv。隨機挑選質(zhì)粒庫pDisplay-ScFv單克隆并進行測序，并將VH及VL基因在IgBlast-IMGT數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果顯示其均為有活性的人免疫球蛋白可變區(qū)基因，從而驗證抗體庫的有效性、多樣性、庫容量（pDisplay-ScFv質(zhì)粒庫的庫容量約為107）。將質(zhì)粒庫瞬時轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，培養(yǎng)60h后收細(xì)胞，利用ScFv蛋白C端帶有的myc標(biāo)簽，用FITC標(biāo)記的抗myc抗體對其進行流式分析實驗，以確定該質(zhì)粒庫能夠得到有效表達于細(xì)胞表面（結(jié)合轉(zhuǎn)染效率，表達效率約為20%）。另外，還收集轉(zhuǎn)染后24h的細(xì)胞，同樣利用myc標(biāo)簽對其進行Western Blot實驗，驗證其抗體庫表達蛋白大小的正確性（約為26kDa）。因此，，我們成功構(gòu)建了一個具有一定多樣性、有效性，并將ScFv抗體表達于哺乳動物細(xì)胞表面的展示型人源ScFv抗體庫。 第二部分哺乳動物細(xì)胞展示型ScFv抗體庫的驗證 近期研究證明，酪氨酸激酶表皮生長因子受體家族成員之一的ErbB3，是表皮生長因子受體-1(epidermal growth factor receptor，EGFR/ErbB1)、表皮生長因子受體-2(v-erb-b2avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog2，ErbB2)抗體藥物臨床應(yīng)用產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵因素，此外還直接參與介導(dǎo)多種ErbB3過表達腫瘤，如人骨肉瘤、黑色素瘤等的發(fā)生、惡化。以ErbB3為靶點的藥物研發(fā)是近年的熱點。在該部分研究中，我們擬基于前期構(gòu)建的哺乳動物細(xì)胞表面的展示型人源ScFv抗體庫，篩選ErbB3ScFv抗體以驗證該抗體庫的有效性和實用性。 首先構(gòu)建ErbB3的胞外區(qū)（extracellular domain，ECD）蛋白及胞外配體結(jié)合區(qū)（receptor ligand-binding domain，RLD）蛋白用于篩選ScFv抗體。利用原核表達系統(tǒng)，將ErbB3的胞外區(qū)ECD基因和胞外配體結(jié)合區(qū)RLD基因分別構(gòu)建至pET-28a(+)和pGEX-KG原核表達載體。通過菌液PCR、測序篩選陽性單克隆。將陽性單克隆轉(zhuǎn)化到原核表達菌BL(DE3)中進行表達并純化。將純化后的ECD蛋白和RLD蛋白標(biāo)記熒光素異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）；通過FITC標(biāo)記的抗原蛋白利用流式細(xì)胞分選技術(shù)（Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS）從文庫中篩選靶向ErbB3的特異性抗體，并對其親和力進行初步檢測。 為驗證實驗設(shè)計的可行性，我們選取PubMed公布的ErbB3ECD ScFv（噬菌體抗體庫中篩選獲得）序列，并將其構(gòu)建到pDisplay載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pDisplay-ErbB3ScFv并混入到質(zhì)粒庫中作為陽性對照。我們分別用10nM、2nM、0.8nM標(biāo)記后蛋白進行三輪流式分選，每輪篩選30ml細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×106/ml。第三輪篩選結(jié)束隨機挑選單克隆測序，在測序得到的35個單克隆序列中，候選序列22號出現(xiàn)9次，候選序列31號出現(xiàn)5次，陽性對照及候選序列20號均出現(xiàn)3次，候選序列9號出現(xiàn)2次，其余均出現(xiàn)1次。之后利用流式細(xì)胞術(shù)對候選序列22號、候選序列9號及陽性對照進行初步親和力測定，結(jié)果顯示候選序列22號親和力為0.72nM，候選序列9號親和力為1.72nM，陽性親和力為0.76nM。同時，在轉(zhuǎn)染后60h，對候選ErbB3ScFv與細(xì)胞系A(chǔ)549中與細(xì)胞內(nèi)源表達的ErbB3進行激光共聚焦共定位實驗，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)源表達的ErbB3在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上均存在，外源蛋白ErbB3ScFv主要定位與細(xì)胞膜，與預(yù)期展示效果一致。 綜上所述，本研究成功構(gòu)建具有一定庫容量、多樣性及有效性的真核哺乳動物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫，并基于該抗體庫成功篩選出具有一定親和力的靶向人ErbB3胞外區(qū)的全人源ScFv抗體。本研究工作為后期篩選各種靶點、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的人源ScFv抗體奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：全人源單鏈抗體 抗體庫 表皮生長因子受體-3
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-21
• 第一部分 哺乳動物細(xì)胞展示型人源 ScFv 抗體庫的構(gòu)建21-46
• 1 材料與方法21-35
• 2 結(jié)果35-43
• 3 討論與小結(jié)43-45
• 4 小結(jié)45-46
• 第二部分 抗體庫驗證46-72
• 第一章 ErbB3 胞外區(qū)及胞外配體結(jié)合區(qū)構(gòu)建、表達46-56
• 1 材料及方法46-52
• 2 結(jié)果52-54
• 3 討論54-55
• 4 小結(jié)55-56
• 第二章 靶向 ErbB3 胞外區(qū)人源 ScFv 抗體的篩選56-72
• 1 材料與方法56-63
• 2 結(jié)果63-69
• 3 討論69-71
• 4 小結(jié)71-72
• 全文總結(jié)72-74
• 參考文獻74-80
• 本人簡歷80-82
• 致謝82-84
• 綜述84-93
• 參考文獻90-93

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：哺乳動物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫構(gòu)建及靶向ErbB3 ScFv篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：308360