本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌PPE37蛋白對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的結(jié)核分枝桿菌全基因組測(cè)序完成后，研究者發(fā)現(xiàn)PE和PPE家族基因占結(jié)核分枝桿菌編碼區(qū)的10％，并且在致病分枝桿菌與非致病的分枝桿菌中存在差異表達(dá)。PPE家族中的PPE37蛋白同時(shí)位于結(jié)核分枝桿菌毒力有關(guān)的RD區(qū)。本論文研究PPE37蛋白在結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體過(guò)程中發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法1.利用生物信息學(xué)軟件（uniprot、protparam、GOR4、SignaIP4.1、Bcepred、NetMHC3.2Server）分析PPE37蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及其B細(xì)胞/T細(xì)胞抗原表位等結(jié)構(gòu)特征，從而預(yù)測(cè)PPE37蛋白在結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體過(guò)程中發(fā)揮的免疫調(diào)控機(jī)制。 2.根據(jù)Gene Bank中登錄的ppe37基因序列（序列號(hào)BX842578），設(shè)計(jì)（primerpremier5軟件）并合成其引物。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組克隆載體pEasy E2-ppe37，經(jīng)PCR、雙酶切、基因測(cè)序證實(shí)無(wú)誤后，克隆至表達(dá)載體pET30a。重組表達(dá)載體pET30a-ppe37經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，利用SDS-PAGE、Western blot分析其表達(dá)形式。利用Ni-NTA瓊脂糖柱對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，并通過(guò)AlpHaImager2200軟件分析其純化率。 3.建立重組PPE37蛋白（濃度為100ng/mL、500ng/mL、5000ng/mL）刺激小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞模型，在24h、48h、72h分別收集細(xì)胞，提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。建立1000ng/mLLPS刺激巨噬細(xì)胞模型作為陽(yáng)性對(duì)照組。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用Real-Time PCR檢測(cè)上述各個(gè)組NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表達(dá)量。 結(jié)果1.生物信息軟件分析證實(shí)PPE37蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、親水性強(qiáng)、無(wú)信號(hào)肽。在線軟件Bcepred顯示PPE37蛋白的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域?yàn)?91-192；288-294；332-336；376-387。在線軟件NetMHC3.2Server顯示PPE37蛋白的T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域?yàn)?-9；144-153；156-165；239-248。這些結(jié)果證明PPE37蛋白在結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體過(guò)程中能被B細(xì)胞/T細(xì)胞識(shí)別，從而發(fā)揮免疫調(diào)控機(jī)制。 2.經(jīng)PCR、雙酶切、基因測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET30a-ppe37。將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組蛋白以包涵體的形式大量表達(dá)。利用AlpHaImager2200軟件分析經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖柱純化后的重組蛋白純化率為96.2%。 3.通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)量的變化，來(lái)觀察PPE37蛋白對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫學(xué)效應(yīng)。濃度分別為100ng/mL、500ng/mL、5000ng/mL的重組蛋白刺激巨噬細(xì)胞，24h后Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比NF-κB、TNF-αmRNA的表達(dá)沒(méi)有影響（p0.05），而IL-6mRNA的表達(dá)上調(diào)（p0.05）；48h后NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)（p0.05）；72h后NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)（p0.05）。1000ng/ml LPS刺激巨噬細(xì)胞，24h、48h、72h均能使NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)（p0.05）。這些差異表達(dá)證實(shí)ppe37蛋白能引起的巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。 結(jié)論在結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體的過(guò)程中PPE37蛋白能夠被B細(xì)胞、T細(xì)胞識(shí)別，從而發(fā)揮相應(yīng)的體液免疫、細(xì)胞免疫反應(yīng)。與此同時(shí)PPE37蛋白也可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的表達(dá)引起巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。總之，PPE37蛋白在結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體的過(guò)程中發(fā)揮重要的免疫學(xué)效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 PPE37蛋白 RAW264.7巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-14
• 第一部分 PPE37 蛋白的生物信息學(xué)分析以及重組原核表達(dá)載體構(gòu)建14-26
• 材料與方法14-22
• 實(shí)驗(yàn)材料14-15
• 實(shí)驗(yàn)方法15-22
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-26
• 第二部分 重組 PPE37 蛋白的原核表達(dá)與純化26-33
• 材料與方法26-31
• 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 實(shí)驗(yàn)方法27-31
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-33
• 第三部分 重組 PPE37 蛋白與巨噬細(xì)胞相互作用的研究33-43
• 材料與方法33-38
• 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 實(shí)驗(yàn)方法34-38
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-43
• 討論43-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 附錄51-59
• 文獻(xiàn)綜述59-72
• 參考文獻(xiàn)65-72
• 致謝72-73
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文73-74
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷74

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  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌PPE37蛋白對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：306560