本文關鍵詞：結核分枝桿菌PPE37蛋白對RAW264.7巨噬細胞NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表達的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的結核分枝桿菌全基因組測序完成后，研究者發(fā)現(xiàn)PE和PPE家族基因占結核分枝桿菌編碼區(qū)的10％，并且在致病分枝桿菌與非致病的分枝桿菌中存在差異表達。PPE家族中的PPE37蛋白同時位于結核分枝桿菌毒力有關的RD區(qū)。本論文研究PPE37蛋白在結核分枝桿菌感染機體過程中發(fā)揮的免疫調節(jié)機制。 方法1.利用生物信息學軟件（uniprot、protparam、GOR4、SignaIP4.1、Bcepred、NetMHC3.2Server）分析PPE37蛋白的理化性質、二級結構及其B細胞/T細胞抗原表位等結構特征，從而預測PPE37蛋白在結核分枝桿菌感染機體過程中發(fā)揮的免疫調控機制。 2.根據Gene Bank中登錄的ppe37基因序列（序列號BX842578），設計（primerpremier5軟件）并合成其引物。利用基因工程技術構建重組克隆載體pEasy E2-ppe37，經PCR、雙酶切、基因測序證實無誤后，克隆至表達載體pET30a。重組表達載體pET30a-ppe37經IPTG誘導表達后，利用SDS-PAGE、Western blot分析其表達形式。利用Ni-NTA瓊脂糖柱對表達蛋白進行純化，并通過AlpHaImager2200軟件分析其純化率。 3.建立重組PPE37蛋白（濃度為100ng/mL、500ng/mL、5000ng/mL）刺激小鼠RAW264.7巨噬細胞模型，在24h、48h、72h分別收集細胞，提取總RNA，利用反轉錄引物反轉錄為cDNA。建立1000ng/mLLPS刺激巨噬細胞模型作為陽性對照組。利用基因工程技術構建細胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的標準質粒，并繪制標準曲線。利用Real-Time PCR檢測上述各個組NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表達量。 結果1.生物信息軟件分析證實PPE37蛋白結構穩(wěn)定、親水性強、無信號肽。在線軟件Bcepred顯示PPE37蛋白的B細胞優(yōu)勢抗原表位區(qū)域為191-192；288-294；332-336；376-387。在線軟件NetMHC3.2Server顯示PPE37蛋白的T細胞優(yōu)勢抗原表位區(qū)域為0-9；144-153；156-165；239-248。這些結果證明PPE37蛋白在結核分枝桿菌感染機體過程中能被B細胞/T細胞識別，從而發(fā)揮免疫調控機制。 2.經PCR、雙酶切、基因測序證實成功構建重組表達載體pET30a-ppe37。將其轉化到E.coli BL21中，，經IPTG誘導，重組蛋白以包涵體的形式大量表達。利用AlpHaImager2200軟件分析經Ni-NTA瓊脂糖柱純化后的重組蛋白純化率為96.2%。 3.通過檢測細胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表達量的變化，來觀察PPE37蛋白對小鼠RAW264.7巨噬細胞的免疫學效應。濃度分別為100ng/mL、500ng/mL、5000ng/mL的重組蛋白刺激巨噬細胞，24h后Real-Time PCR檢測結果顯示與空白對照組相比NF-κB、TNF-αmRNA的表達沒有影響（p0.05），而IL-6mRNA的表達上調（p0.05）；48h后NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表達顯著上調（p0.05）；72h后NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表達顯著上調（p0.05）。1000ng/ml LPS刺激巨噬細胞，24h、48h、72h均能使NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表達顯著上調（p0.05）。這些差異表達證實ppe37蛋白能引起的巨噬細胞免疫應答反應。 結論在結核分枝桿菌感染機體的過程中PPE37蛋白能夠被B細胞、T細胞識別，從而發(fā)揮相應的體液免疫、細胞免疫反應。與此同時PPE37蛋白也可以通過調控細胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的表達引起巨噬細胞免疫應答反應�？傊�，PPE37蛋白在結核分枝桿菌感染機體的過程中發(fā)揮重要的免疫學效應。
【關鍵詞】：結核分枝桿菌 PPE37蛋白 RAW264.7巨噬細胞
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-14
• 第一部分 PPE37 蛋白的生物信息學分析以及重組原核表達載體構建14-26
• 材料與方法14-22
• 實驗材料14-15
• 實驗方法15-22
• 實驗結果22-26
• 第二部分 重組 PPE37 蛋白的原核表達與純化26-33
• 材料與方法26-31
• 實驗材料26-27
• 實驗方法27-31
• 實驗結果31-33
• 第三部分 重組 PPE37 蛋白與巨噬細胞相互作用的研究33-43
• 材料與方法33-38
• 實驗材料33-34
• 實驗方法34-38
• 實驗結果38-43
• 討論43-46
• 結論46-47
• 參考文獻47-51
• 附錄51-59
• 文獻綜述59-72
• 參考文獻65-72
• 致謝72-73
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文73-74
• 個人簡歷74

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本文編號：306560