目的:本研究通過RNA-seq技術(shù)分析Srsf1基因表達(dá)敲低的GT1-7細(xì)胞（knock down, KD）和野生型GT1-7細(xì)胞（wide type,WT）的表達(dá)譜和可變剪接事件,研究Srsf1敲低對(duì)GT1-7細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。方法:利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的Srsf1基因表達(dá)敲低的GT1-7細(xì)胞（SRSF1-KD）和野生型GT1-7細(xì)胞分別抽提RNA,做RNA-seq數(shù)據(jù)分析,利用r MATS軟件分析兩株細(xì)胞內(nèi)可變剪接事件的變化,確定Srsf1調(diào)控的下游關(guān)鍵基因。結(jié)果:結(jié)果顯示共有875個(gè)基因表達(dá)存在顯著性差異,對(duì)這些基因進(jìn)行KEGG通路分析,發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸能突觸、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等與性發(fā)育相關(guān)的通路均受到影響。此外,P53通路也受到Srsf1敲低的影響。利用r MATS軟件進(jìn)行可變剪接事件分析,顯示共發(fā)生839個(gè)可變剪接事件,涉及719個(gè)基因,進(jìn)行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)與性發(fā)育相關(guān)的MAPK信號(hào)通路受到影響。結(jié)論:成功檢測(cè)了GT1-7細(xì)胞和Srsf1基因敲低的GT1-7細(xì)胞表達(dá)譜,通過分析基因表達(dá)差異以及可變剪接事件,證明了Srsf1對(duì)于PI3K-Akt信號(hào)通... 

【文章來源】：現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2019,19(14)

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

GT1-7和SRSF1-KD細(xì)胞中Srsf1mRNA表達(dá)Fig.1mRNAexpressionofSrsf1inGT1-7cellsandSRSF1-KDcells

rsf1的表達(dá)水平如圖1所示，SRSF1-KD細(xì)胞中Srsf1基因表達(dá)量相對(duì)野生型GT1-7的表達(dá)量顯著降低40.2%（P<0.01）。2.2差異表達(dá)基因分析通過對(duì)GT1-7細(xì)胞和Srsf1-KD細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析，共檢測(cè)10354個(gè)基因，我們確定了875個(gè)發(fā)生顯著差異表達(dá)的基因，其中523個(gè)基因上調(diào)，352個(gè)基因下調(diào)。上調(diào)倍數(shù)較大的基因Uaca、Kcnk2、Dbx2和Rassf4，分別上調(diào)8.5、6.8、6.8和6.3倍；下調(diào)倍數(shù)較大的基因有Cdh8、St18、Cd55和Slc16a7，分別下調(diào)6.2、6.1、5.8和5.3倍；其他大多數(shù)基因的表達(dá)量變化在2~3倍。使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路分析（圖2），結(jié)果顯示，顯著性最高的前20個(gè)通路中，已知與性發(fā)育相關(guān)的通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、γ-氨基丁酸能突觸通路。此外，P53通路也受到影響。參與PI3K-Akt信號(hào)通路的基因中表達(dá)量變化較大的基因有Col4a5、Kdr、Pdgfb，分別下調(diào)3.4倍、3.0倍和上調(diào)2.6倍。參與MAPK信號(hào)通路的基因中表達(dá)量變化較大的基因有Fos、Pdgfb、Fas，分別下調(diào)2.8倍和上調(diào)2.6倍、2.0倍。參與γ-氨基丁酸能突觸的基因中表達(dá)量變化較大的基因有Gabrg1、Adcy8、Gnb4，分別下調(diào)3.6倍、上調(diào)3.1倍和2.2倍。另外，P53通路也受到SRSF1敲低的影響，其中表達(dá)量變化較大的基因有Steap3、Fas，分別上調(diào)5.1倍、2.0倍�；騊dgfb同時(shí)參與PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路，基因Fas同時(shí)參與MAPK信號(hào)通路和P53通路，而且兩個(gè)表達(dá)量變化幅度較大。2.3Real-timePCR驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果隨機(jī)選擇富集到PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路中的五個(gè)基因Col4a5、Fas、Gnb4、Mapk13和Dusp7，對(duì)RNA-Seq結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。這5個(gè)基因在兩種細(xì)胞中均穩(wěn)定表達(dá)，且表達(dá)量均有顯著性變化（圖3A）。Real-timePCR檢測(cè)顯示這5個(gè)基因的變化趨勢(shì)與RNA-Seq結(jié)果是一致的（圖3B）。

較大的基因有Gabrg1、Adcy8、Gnb4，分別下調(diào)3.6倍、上調(diào)3.1倍和2.2倍。另外，P53通路也受到SRSF1敲低的影響，其中表達(dá)量變化較大的基因有Steap3、Fas，分別上調(diào)5.1倍、2.0倍。基因Pdgfb同時(shí)參與PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路，基因Fas同時(shí)參與MAPK信號(hào)通路和P53通路，而且兩個(gè)表達(dá)量變化幅度較大。2.3Real-timePCR驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果隨機(jī)選擇富集到PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路中的五個(gè)基因Col4a5、Fas、Gnb4、Mapk13和Dusp7，對(duì)RNA-Seq結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。這5個(gè)基因在兩種細(xì)胞中均穩(wěn)定表達(dá)，且表達(dá)量均有顯著性變化（圖3A）。Real-timePCR檢測(cè)顯示這5個(gè)基因的變化趨勢(shì)與RNA-Seq結(jié)果是一致的（圖3B）。2.4差異可變剪接基因分析使用剪接分析軟件rMATS處理RNA-seq數(shù)據(jù)，得到兩個(gè)樣本間存在顯著差異的可變剪接事件共839個(gè)，發(fā)生顯著差異可變剪接的基因共719個(gè)，絕大多數(shù)基因發(fā)生外顯子跳躍類型的可變剪接（表2）。對(duì)所有顯著差異可變剪接基因進(jìn)行KEGG通路分析（圖4），結(jié)果顯示共富集到12個(gè)信號(hào)通路，其中已知與性發(fā)育相關(guān)的通路只有MAPK信號(hào)通路，共14個(gè)基因富集到該通路，其中13個(gè)基因發(fā)生的可變剪接事件類型是外顯子跳躍（SE），1個(gè)基因發(fā)生的可變剪接事件類型是可變3'剪接位點(diǎn)。3討論GnRH神經(jīng)元脈沖釋放GnRH激素是性發(fā)育啟動(dòng)的標(biāo)志事件，GT1-7細(xì)胞作為GnRH神經(jīng)元的離體細(xì)胞模型，是研究圖1GT1-7和SRSF1-KD細(xì)胞中Srsf1mRNA表達(dá)Fig.1mRNAexpressionofSrsf1inGT1-7cellsandSRSF1-KDcellsNote:BarsaremeansandverticalbarsrepresentSEM（**:P<0.01）.圖2顯著差異表達(dá)基因的KEGG通路分析�？v坐標(biāo)代表代謝通路類別，橫坐標(biāo)代表P值(P<0.05，5％FDR)Fig.2Thesignificantsignalingpathwaysofthedifferentiallyexpressedgenes.Thevertical

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Fkbp51基因敲除對(duì)小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組基因可變剪接的影響[J]. 周志強(qiáng),楊志偉,雍偉東.  中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志. 2017(05)
[2]GT1-7細(xì)胞及其在生殖相關(guān)研究中的應(yīng)用[J]. 馮濤,吳曉敏,許曉玲,白佳樺,宋玉清,肖霖力,韓向敏,劉彥.  東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(01)



本文編號(hào)：3059750