目的:本研究通過RNA-seq技術(shù)分析Srsf1基因表達敲低的GT1-7細胞（knock down, KD）和野生型GT1-7細胞（wide type,WT）的表達譜和可變剪接事件,研究Srsf1敲低對GT1-7細胞基因表達譜的影響。方法:利用實驗室現(xiàn)有的Srsf1基因表達敲低的GT1-7細胞（SRSF1-KD）和野生型GT1-7細胞分別抽提RNA,做RNA-seq數(shù)據(jù)分析,利用r MATS軟件分析兩株細胞內(nèi)可變剪接事件的變化,確定Srsf1調(diào)控的下游關(guān)鍵基因。結(jié)果:結(jié)果顯示共有875個基因表達存在顯著性差異,對這些基因進行KEGG通路分析,發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸能突觸、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等與性發(fā)育相關(guān)的通路均受到影響。此外,P53通路也受到Srsf1敲低的影響。利用r MATS軟件進行可變剪接事件分析,顯示共發(fā)生839個可變剪接事件,涉及719個基因,進行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)與性發(fā)育相關(guān)的MAPK信號通路受到影響。結(jié)論:成功檢測了GT1-7細胞和Srsf1基因敲低的GT1-7細胞表達譜,通過分析基因表達差異以及可變剪接事件,證明了Srsf1對于PI3K-Akt信號通... 

【文章來源】：現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展. 2019,19(14)

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【部分圖文】：

GT1-7和SRSF1-KD細胞中Srsf1mRNA表達Fig.1mRNAexpressionofSrsf1inGT1-7cellsandSRSF1-KDcells

rsf1的表達水平如圖1所示，SRSF1-KD細胞中Srsf1基因表達量相對野生型GT1-7的表達量顯著降低40.2%（P<0.01）。2.2差異表達基因分析通過對GT1-7細胞和Srsf1-KD細胞進行RNA-seq分析，共檢測10354個基因，我們確定了875個發(fā)生顯著差異表達的基因，其中523個基因上調(diào)，352個基因下調(diào)。上調(diào)倍數(shù)較大的基因Uaca、Kcnk2、Dbx2和Rassf4，分別上調(diào)8.5、6.8、6.8和6.3倍；下調(diào)倍數(shù)較大的基因有Cdh8、St18、Cd55和Slc16a7，分別下調(diào)6.2、6.1、5.8和5.3倍；其他大多數(shù)基因的表達量變化在2~3倍。使用KEGG數(shù)據(jù)庫進行代謝通路分析（圖2），結(jié)果顯示，顯著性最高的前20個通路中，已知與性發(fā)育相關(guān)的通路有PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、γ-氨基丁酸能突觸通路。此外，P53通路也受到影響。參與PI3K-Akt信號通路的基因中表達量變化較大的基因有Col4a5、Kdr、Pdgfb，分別下調(diào)3.4倍、3.0倍和上調(diào)2.6倍。參與MAPK信號通路的基因中表達量變化較大的基因有Fos、Pdgfb、Fas，分別下調(diào)2.8倍和上調(diào)2.6倍、2.0倍。參與γ-氨基丁酸能突觸的基因中表達量變化較大的基因有Gabrg1、Adcy8、Gnb4，分別下調(diào)3.6倍、上調(diào)3.1倍和2.2倍。另外，P53通路也受到SRSF1敲低的影響，其中表達量變化較大的基因有Steap3、Fas，分別上調(diào)5.1倍、2.0倍�；騊dgfb同時參與PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路，基因Fas同時參與MAPK信號通路和P53通路，而且兩個表達量變化幅度較大。2.3Real-timePCR驗證RNA-Seq結(jié)果隨機選擇富集到PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路中的五個基因Col4a5、Fas、Gnb4、Mapk13和Dusp7，對RNA-Seq結(jié)果進行驗證。這5個基因在兩種細胞中均穩(wěn)定表達，且表達量均有顯著性變化（圖3A）。Real-timePCR檢測顯示這5個基因的變化趨勢與RNA-Seq結(jié)果是一致的（圖3B）。

較大的基因有Gabrg1、Adcy8、Gnb4，分別下調(diào)3.6倍、上調(diào)3.1倍和2.2倍。另外，P53通路也受到SRSF1敲低的影響，其中表達量變化較大的基因有Steap3、Fas，分別上調(diào)5.1倍、2.0倍�；騊dgfb同時參與PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路，基因Fas同時參與MAPK信號通路和P53通路，而且兩個表達量變化幅度較大。2.3Real-timePCR驗證RNA-Seq結(jié)果隨機選擇富集到PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路中的五個基因Col4a5、Fas、Gnb4、Mapk13和Dusp7，對RNA-Seq結(jié)果進行驗證。這5個基因在兩種細胞中均穩(wěn)定表達，且表達量均有顯著性變化（圖3A）。Real-timePCR檢測顯示這5個基因的變化趨勢與RNA-Seq結(jié)果是一致的（圖3B）。2.4差異可變剪接基因分析使用剪接分析軟件rMATS處理RNA-seq數(shù)據(jù)，得到兩個樣本間存在顯著差異的可變剪接事件共839個，發(fā)生顯著差異可變剪接的基因共719個，絕大多數(shù)基因發(fā)生外顯子跳躍類型的可變剪接（表2）。對所有顯著差異可變剪接基因進行KEGG通路分析（圖4），結(jié)果顯示共富集到12個信號通路，其中已知與性發(fā)育相關(guān)的通路只有MAPK信號通路，共14個基因富集到該通路，其中13個基因發(fā)生的可變剪接事件類型是外顯子跳躍（SE），1個基因發(fā)生的可變剪接事件類型是可變3'剪接位點。3討論GnRH神經(jīng)元脈沖釋放GnRH激素是性發(fā)育啟動的標(biāo)志事件，GT1-7細胞作為GnRH神經(jīng)元的離體細胞模型，是研究圖1GT1-7和SRSF1-KD細胞中Srsf1mRNA表達Fig.1mRNAexpressionofSrsf1inGT1-7cellsandSRSF1-KDcellsNote:BarsaremeansandverticalbarsrepresentSEM（**:P<0.01）.圖2顯著差異表達基因的KEGG通路分析�？v坐標(biāo)代表代謝通路類別，橫坐標(biāo)代表P值(P<0.05，5％FDR)Fig.2Thesignificantsignalingpathwaysofthedifferentiallyexpressedgenes.Thevertical

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Fkbp51基因敲除對小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組基因可變剪接的影響[J]. 周志強,楊志偉,雍偉東.  中國比較醫(yī)學(xué)雜志. 2017(05)
[2]GT1-7細胞及其在生殖相關(guān)研究中的應(yīng)用[J]. 馮濤,吳曉敏,許曉玲,白佳樺,宋玉清,肖霖力,韓向敏,劉彥.  東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2016(01)



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