發(fā)布時(shí)間：2017-04-14 04:12

  本文關(guān)鍵詞：以枯草桿菌芽孢呈遞系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新型流感疫苗基礎(chǔ)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本研究利用枯草桿菌芽孢展示外源抗原的芽孢呈遞技術(shù)，制備出表面展示流感病毒保守抗原M2蛋白胞外區(qū)（M2e）的重組芽孢，并作為流感病毒新型候選疫苗開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，，對(duì)其免疫原性及免疫保護(hù)效果進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，為發(fā)展以枯草桿菌芽孢呈遞系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新型流感疫苗奠定研究基礎(chǔ)。 方法:（1）將枯草桿菌CotB基因構(gòu)建到基因組整合質(zhì)粒pDG1664中，再將3個(gè)串聯(lián)的M2e分子基因連接到CotB基因的下游，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pDG1664-CotB-M2e3；通過(guò)同源重組的方式，將外源基因CotB-M2e3整合到PY79枯草桿菌基因組中。利用紅霉素抗性篩選重組菌并挑取重組子單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取基因組以PCR擴(kuò)增和測(cè)序方式鑒定是否正確整合了M2e抗原基因；通過(guò)SDS-PAGE、Western Blot鑒定芽孢蛋白中流感病毒M2e抗原的表達(dá)情況，并采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光方法進(jìn)一步確定M2e抗原在芽孢表面的表達(dá)。利用形態(tài)學(xué)觀察、API CH50和API20E生化實(shí)驗(yàn)及16s rRNA分析等實(shí)驗(yàn)對(duì)重組芽孢的生長(zhǎng)狀態(tài)、生化特征等進(jìn)行了分析和鑒定。（2）為了進(jìn)一步分析表達(dá)流感M2e的重組芽孢的免疫原性和免疫保護(hù)性，我們應(yīng)用表達(dá)流感M2e的重組芽孢進(jìn)行動(dòng)物免疫和動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)。在不使用佐劑的情況下用重組芽孢直接口服免疫小鼠，首次連續(xù)口服免疫3天，待首次免疫4周后再連續(xù)免疫3天，之后于距首次免疫5周時(shí)進(jìn)行末次免疫，分別在首次免疫后5、7、9、11、13、15、17周尾靜脈采血并分離血清進(jìn)行體液免疫反應(yīng)的檢測(cè)和分析；同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞免疫水平；通過(guò)攻毒保護(hù)性試驗(yàn)對(duì)這種新型候選疫苗進(jìn)行免疫保護(hù)性評(píng)價(jià)。 結(jié)果：（1）表達(dá)流感病毒M2e的重組枯草桿菌芽孢的制備及鑒定：優(yōu)化條件后，采用電轉(zhuǎn)化方法將pDG1664-CotB-M2e3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至PY79感受態(tài)菌；轉(zhuǎn)化菌經(jīng)PCR檢測(cè)和基因測(cè)序鑒定表明，重組芽孢基因組中正確整合了M2e抗原基因。重組芽孢經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析證實(shí)，流感病毒M2e抗原在重組芽孢中成功表達(dá)；采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光方法檢測(cè)進(jìn)一步確定了M2e抗原表達(dá)呈遞在重組芽孢表面，形成的重組芽孢表面蛋白（CotB-M2e融合蛋白）分子量約為37kDa。實(shí)驗(yàn)研究表明，我們成功制備出整合了M2e基因重組枯草芽孢菌株（命名RSM2e31）。利用電子顯微鏡檢測(cè)技術(shù)及重組芽孢傳代培養(yǎng)，進(jìn)行重組芽孢形態(tài)學(xué)觀察和分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組菌株RSM2e31能與野生株一樣形成芽孢，并且外源基因能夠在重組桿菌芽孢中穩(wěn)定存在；對(duì)重組芽孢菌進(jìn)行的生化反應(yīng)（API CH50及API20E）實(shí)驗(yàn)及16s rRNA測(cè)序結(jié)果分析表明，重組株仍屬于枯草芽孢桿菌屬。重組芽孢的生長(zhǎng)狀態(tài)如菌落形成和生化反應(yīng)等雖然與野生枯草芽孢桿菌有稍許變化，但重組株的基本生化特性與野生株具有較好的一致性。 （2）表達(dá)流感病毒M2e的重組枯草桿菌芽孢免疫原性及免疫反應(yīng)特征分析：為了進(jìn)一步分析表達(dá)流感M2e的重組芽孢的免疫原性和觀察其免疫反應(yīng)特征，本研究采用口服免疫的方式免疫小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。小鼠免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RSM2e31重組芽孢不添加佐劑進(jìn)行口服免疫能夠誘導(dǎo)出良好的體液免疫應(yīng)答，并且免疫后17周抗體水平處于較高的水平（1:11200）。抗體亞類分析表明重組芽孢誘導(dǎo)的IgG抗體以IgG1為主。進(jìn)一步取免疫小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行的胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RSM2e31重組芽孢免疫可以有效誘導(dǎo)M2e抗原特異性Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答。小鼠肺和腸灌洗液sIgA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組芽孢還能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的粘膜免疫應(yīng)答。 （3）表達(dá)流感病毒M2e的重組枯草桿菌芽孢疫苗的攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)研究：采用A/PR/8/34(H1N1)流感病毒以103TCID50劑量對(duì)免疫后17周小鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。野生株芽孢免疫組、PBS對(duì)照免疫組小鼠的存活率僅為10%，而RSM2e31重組芽孢免疫小鼠全部存活。肺組織病毒滴度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RSM2e31重組芽孢免疫小鼠肺組織病毒滴度顯著降低，表明體內(nèi)病毒復(fù)制得到有效抑制。由此可見(jiàn)，RSM2e31重組芽孢具有良好的免疫保護(hù)作用。 結(jié)論:本研究針對(duì)流感病毒M2e保守性抗原建立了枯草桿菌芽孢呈遞技術(shù)方法，制備出在枯草桿菌芽孢表面穩(wěn)定表達(dá)外源M2e蛋白的重組株。獲得的重組芽孢免疫小鼠不僅誘導(dǎo)產(chǎn)生了有效地體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，也產(chǎn)生了粘膜免疫反應(yīng)；表達(dá)流感病毒M2e的重組枯草芽孢疫苗免疫小鼠使其對(duì)病毒的感染產(chǎn)生了完全保護(hù)作用。該研究是對(duì)發(fā)展以枯草芽孢呈遞系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新型口服流感疫苗的創(chuàng)新性探索，為其深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：枯草桿菌 芽孢 流感 M2e 疫苗
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 表面展示流感病毒 M2e 抗原的枯草桿菌重組芽孢的制備及其生物學(xué)特征分析16-44
• 引言16-17
• 1 材料與方法17-28
• 2 結(jié)果28-42
• 3 討論42-44
• 第二部分 表面展示流感病毒 M2e 抗原的枯草桿菌重組芽孢的免疫原性分析與免疫保護(hù)評(píng)價(jià)44-58
• 引言44-45
• 1 材料與方法45-48
• 2 結(jié)果48-55
• 3 討論55-58
• 結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 附錄66-70
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷70-71
• 致謝71-72
• 綜述72-80
• 參考文獻(xiàn)78-80

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 杜立新;蘇云金芽胞桿菌cry8E基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：以枯草桿菌芽孢呈遞系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新型流感疫苗基礎(chǔ)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：305183