本文關(guān)鍵詞：中東呼吸綜合征冠狀病毒S1蛋白的重組表達(dá)與免疫學(xué)功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的: 中東呼吸綜合征（Middle East Respiratory Syndrome，MERS）是由中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）感染引起的，這是一種新型高致病性冠狀病毒。活病毒中和試驗(yàn)一直是檢測血清抗體中和活性、評價抗體抗病毒作用的重要方法，但高致病病毒的活病毒中和試驗(yàn)需要高等級生物安全實(shí)驗(yàn)條件。為了克服MERS-CoV活病毒感染和中和試驗(yàn)在安全、效率等方面存在的諸多困難和不便，本研究建立了一種具有一次感染能力而無復(fù)制能力的MERS假病毒，它可以作為一種安全、有效的技術(shù)手段應(yīng)用于MERS-CoV疫苗與抗體評價以及病毒致病機(jī)制研究。MERS-CoV S蛋白在介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞中占據(jù)重要作用， S蛋白可以為MERS-CoV感染細(xì)胞提供結(jié)合位點(diǎn)。本研究重組表達(dá)的S1蛋白具有受體結(jié)合區(qū)，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體可以幫助MERS感染者抵抗病毒的再次入侵以及作為疫苗預(yù)防MERS-CoV的感染，S1蛋白可以為MERS-CoV致病機(jī)制研究以及新型抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)提供靶點(diǎn)。 方法: 將MERS-CoV S基因整合到載體pcDNA3.1中成為含有MERS-CoV S基因的重組質(zhì)粒（pcDNA3.1-MERS-S），與缺失Env基因、含有熒光素酶報告基因的HIV-1骨架質(zhì)粒（pNL4-3.Luc.RE）共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲含有假病毒的上清。通過蛋白印跡、細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)和血清中和試驗(yàn)，確定是否成功包裝出MERS假病毒，并能夠有效應(yīng)用于細(xì)胞感染與中和試驗(yàn)。 將MERS-CoV S1基因整合到真核表達(dá)載體pJW4303中成為含有MERS-CoV S1基因的重組質(zhì)粒（pJW4303-MERS-S1），通過轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞在上清中獲得重組蛋白，經(jīng)過純化的重組蛋白作為包被抗原與MERS-CoV特異性抗體RBD-Fc進(jìn)行ELISA檢測從而確定重組表達(dá)的MERS-CoV S1蛋白是否具有抗原性。為了進(jìn)一步確定重組蛋白S1是否具有免疫原性和免疫保護(hù)性，使用佐劑以皮下注射的方式免疫小鼠，于首次免疫后每三周免疫一次，共免疫三次，每次免疫后兩周采集小鼠尾靜脈血液，血清分離后通過流式細(xì)胞檢測技術(shù)、假病毒系統(tǒng)及活病毒檢測確定重組蛋白S1免疫血清是否具有中和活性。 結(jié)果: 成功包裝出MERS假病毒pMERS-S，包裝出的假病毒含有MERS-CoV S蛋白，并能夠有效感染MERS-CoV敏感細(xì)胞系（HuH-7細(xì)胞）。MERS假病毒能夠應(yīng)用于抗體中和活性檢測，在中和試驗(yàn)中被MERS-CoV中和抗體所中和而失去感染性。 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pJW4303-MERS-S1成功的在COS7細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白MERS-CoV S1，經(jīng)Western blot鑒定正確，純化后的重組蛋白免疫小鼠獲得免疫血清，流式細(xì)胞檢測技術(shù)的結(jié)果表明重組的MERS-CoV S1蛋白免疫血清可以成功阻斷病毒RBD與受體細(xì)胞的結(jié)合，并且隨著免疫血清稀釋度的增加，這種中和作用逐漸減弱，假病毒中和實(shí)驗(yàn)及活病毒中和實(shí)驗(yàn)均表明，該免疫血清可以中和特異性的病毒，具有中和活性。 結(jié)論: 本研究建立了不依賴于BSL-3高等級生物安全條件的MERS假病毒系統(tǒng)，并有效應(yīng)用于中和抗體檢測，為MERS-CoV疫苗、藥物評價及病毒致病機(jī)制研究提供了一種良好的技術(shù)支撐手段。本研究中，重組表達(dá)的S1蛋白可以與MERS-CoV特異性單抗發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，并且可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體，進(jìn)一步通過成功構(gòu)建的假病毒系統(tǒng)、流式細(xì)胞術(shù)阻斷實(shí)驗(yàn)及活病毒中和實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，最終證明該重組蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有中和活性，說明S1在介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合上起到了至關(guān)重要的作用，它可作為疫苗預(yù)防MERS-CoV的感染，并且其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可以幫助MERS感染者抵抗病毒的再次入侵。因此，本研究重組表達(dá)的S1蛋白可以為MERS-CoV致病機(jī)制研究以及新型抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)提供靶點(diǎn)，從而使MERS防患于未然。
【關(guān)鍵詞】：MERS-CoV 中和實(shí)驗(yàn) 假病毒 免疫保護(hù)性 疫苗
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.1
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 前言13-15
• 第一部分 中東呼吸綜合征冠狀病毒假病毒系統(tǒng)的建立15-28
• 1 材料15-18
• 1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞15
• 1.2 MERS-CoV S 基因15-16
• 1.3 主要材料和試劑16
• 1.4 主要儀器設(shè)備16
• 1.5 主要試劑配方16-18
• 2 方法18-23
• 2.1 pMERS-S 的質(zhì)粒構(gòu)建18-21
• 2.2 假病毒的制備21
• 2.3 Western blot 鑒定重組質(zhì)粒 pMERS-S 的表達(dá)21-22
• 2.4 MERS 假病毒感染力測定22
• 2.5 MERS 假病毒中和試驗(yàn)22-23
• 2.6 統(tǒng)計分析23
• 3 結(jié)果23-26
• 4 討論26-28
• 第二部分 中東呼吸綜合征冠狀病毒 S1 蛋白的重組表達(dá)與免疫學(xué)功能研究28-43
• 1 材料28-30
• 1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞28
• 1.2 引物28
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動物28
• 1.4 主要材料和試劑28-29
• 1.5 主要儀器設(shè)備29
• 1.6 主要試劑配方29-30
• 2 方法30-35
• 2.1 重組 pS1-PJW4303 質(zhì)粒的構(gòu)建30-32
• 2.2 質(zhì)粒 pS1-PJW4303 的表達(dá)32-33
• 2.3 純化蛋白的濃度測定33
• 2.4 ELISA 檢測 MERS-CoV 受體結(jié)合區(qū)特異性小鼠單克隆抗體滴度33
• 2.5 動物免疫及血清收集33-34
• 2.6 ELISA 檢測 MERS S1 血清抗體滴度34
• 2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫血清對病毒 RBD 與受體結(jié)合的阻斷作用34
• 2.8 假病毒中和抗體檢測34
• 2.9 活病毒中和抗體檢測34
• 2.10 統(tǒng)計分析34-35
• 3 結(jié)果35-42
• 4 討論42-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 綜述48-53
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 致謝53-54
• 作者簡介54-55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 段昭君;譚文杰;魯鳳民;;中東呼吸綜合征冠狀病毒感染[J];中國病毒病雜志;2013年04期

  本文關(guān)鍵詞：中東呼吸綜合征冠狀病毒S1蛋白的重組表達(dá)與免疫學(xué)功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：304847