本文關(guān)鍵詞：Moesin磷酸化在1-磷酸鞘氨醇介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血管內(nèi)皮在循環(huán)和周圍組織之間作為半選擇性屏障參與調(diào)節(jié)很多生理過程,比如蛋白質(zhì)和物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、炎癥和血管新生�？寡追磻�(yīng)介導(dǎo)的內(nèi)皮屏障功能障礙是膿毒癥引起血管滲出和肺水腫直接的根本原因,也是血管新生、腫瘤代謝和動(dòng)脈粥樣硬化必不可少的因素。因此,保持內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的完整性具有重要的臨床治療意義。 前人的研究已經(jīng)提出這樣一種內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能調(diào)節(jié)模型,即血管屏障功能由抗內(nèi)皮細(xì)胞收縮力(這種收縮力產(chǎn)生向心性張力)和細(xì)胞間粘附及細(xì)胞基質(zhì)的約束力(這種約束力由焦附著力和粘附連接強(qiáng)制產(chǎn)生)的平衡來調(diào)節(jié),這二者也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)的改變。 血小板源性磷脂1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, SIP)可有效提高內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能,這一過程涉及由GTP酶依賴性Rac介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞周邊的重排。S1P是一種存在于血漿中的具有生物活性的神經(jīng)鞘磷脂,主要由血小板合成和分泌,其他細(xì)胞如紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞都能夠分泌SIP。SIP的濃度可通過復(fù)雜的代謝過程而被調(diào)節(jié),其濃度的變化直接影響其生物學(xué)效應(yīng)。S1P在細(xì)胞內(nèi)可作為第二信使,與調(diào)節(jié)性分子如酶、通道蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等相互作用而發(fā)揮效應(yīng)；S1P還可以作為細(xì)胞外配體,與幾乎存在于所有細(xì)胞種類的S1P膜受體結(jié)合,并通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,影響細(xì)胞的生存、增殖、分化、遷移和形態(tài)變化等,發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。S1P受體為G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors, GPCR),目前至少發(fā)現(xiàn)有5種,分別為S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5,分布于不同的細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)S1PR1、S1PR2和S1PR3,表達(dá)水平S1PR1S1PR3S1PR2。不同亞型的S1P受體結(jié)合的G蛋白不盡相同,其中S1PR1與Gi相偶聯(lián),S1PR2/3則與Gi, Gq、G12/13偶聯(lián)。另外,S1PR1和S1PR2/3對(duì)S1P的親和力也有區(qū)別,生理濃度下S1P主要與S1PR1結(jié)合；濃度較高(如超過5μmol/L時(shí))則與S1PR2/3結(jié)合。有研究發(fā)現(xiàn),生理濃度(0.5μmol/L-1.0μmol/L)下S1P與S1PR1結(jié)合,介導(dǎo)Rac1依賴的內(nèi)皮屏障保護(hù)作用；濃度較高時(shí)(5.0μmol/L-10.0μmol/L),則與S1PR2/3結(jié)合,介導(dǎo)RhoA依賴的內(nèi)皮屏障損傷作用。三種受體表達(dá)及激活狀態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡維持著正常內(nèi)皮細(xì)胞的功能。我們的前期研究工作證明,內(nèi)毒素和腫瘤壞死因子等炎性刺激可增加S1PR2的表達(dá),并在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷中發(fā)揮重要作用。 由S1P和其他保護(hù)因素如氧化磷脂、人生長(zhǎng)因子、ATP或辛伐他丁需要肌動(dòng)球蛋白重塑,包括在細(xì)胞周邊肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成,磷酸化調(diào)節(jié)的肌球蛋白輕鏈在細(xì)胞周邊的聚集,以及Rac依賴機(jī)制調(diào)節(jié)的中心應(yīng)力纖維的消失。然而這些導(dǎo)致細(xì)胞骨架改變的信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)還未完全明了。生理濃度下S1P對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的保護(hù)作用具有重要的臨床治療意義,有可能為感染、損傷等病理狀態(tài)下的組織炎癥,特別是為血管通透性的升高所導(dǎo)致的組織水腫提供治療途徑。因此,深入研究不同濃度的S1P對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的影響和機(jī)制,對(duì)于將來在治療上發(fā)揮并加強(qiáng)S1P的內(nèi)源性血管通透性穩(wěn)定因子的作用、防治過量S1P所引起的內(nèi)皮屏障功能損傷等具有重要的意義。 普遍存在的ERM家族膜相關(guān)蛋白(ezrin,radixin,moesin)調(diào)控特定域的細(xì)胞周邊的結(jié)構(gòu)和功能。ERM蛋白是連接肌動(dòng)蛋白絲和漿膜的肌動(dòng)蛋白結(jié)合連接蛋白,或者直接通過結(jié)合跨膜蛋白或間接通過肌球蛋白連接到跨膜蛋白上。ERM蛋白參與細(xì)胞粘附、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和膜整合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等細(xì)胞生命活動(dòng)�；罨癄顟B(tài)的ERM蛋白受磷酸化反應(yīng)的嚴(yán)格調(diào)控。ERM蛋白激活的方式主要有兩種,一是通過與膜脂質(zhì)PIP2結(jié)合,另一種是通過保守的C端蘇氨酸的磷酸化(ezrin的T567,radixin的T564,moesin的T558)而被激活。幾種激酶已應(yīng)用于通過磷酸化C端蘇氨酸殘基來調(diào)節(jié)ERM蛋白的功能。 ERM蛋白也可與信號(hào)分子聯(lián)合參與細(xì)胞生命過程(需要膜細(xì)胞骨架重組)。ERM蛋白似乎在GTP酶家族的Rho的下游和上游都起調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架的重塑的作用。然而,目前有關(guān)ERM蛋白在對(duì)不同興奮劑引起的內(nèi)皮細(xì)胞骨架重塑中發(fā)揮的可能作用研究不多。Koss和他的同事認(rèn)為ERM蛋白在蘇氨酸殘基上由TNF-α介導(dǎo)磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程并有可能在調(diào)制細(xì)胞骨架變化和在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高中起重要作用。我們的前期研究工作證明,晚期糖基化終產(chǎn)物通過激活RhoA進(jìn)而導(dǎo)致其下游靶分子ROCK的磷酸化,并通過直接與moesin蛋白相互作用激活moesin蛋白,進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的改變,血管通透性增加。 已有研究證明,ERM蛋白是生理濃度S1P保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能反應(yīng)的必需條件,Radixin在促進(jìn)S1P介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞屏障保護(hù)功能中有特異性的促進(jìn)作用,而noesin則相反,對(duì)這一過程起抑制作用。三種不同的ERM蛋白差異性地調(diào)控由S1P介導(dǎo)的肺內(nèi)皮細(xì)胞骨架和通透性的變化。鑒于moesin在血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能下降和血管通透性升高中的促進(jìn)作用,我們推測(cè)moesin蛋白在高濃度S1P引起的血管通透性增加中可能有作用,所以本課題主要研究moesin磷酸化在高濃度S1P介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能障礙中的作用。 目的 我們前面已經(jīng)描述：生理劑量的S1P(0.5μmol/L-1.0μmol/L)與S1PR1結(jié)合,介導(dǎo)Racl依賴的內(nèi)皮屏障保護(hù)作用；而高濃度的S1P(5.0μmol/L-10.0μmol/L)與S1PR2/3結(jié)合,介導(dǎo)RhoA依賴的內(nèi)皮屏障損傷作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證明：1.AGEs通過誘導(dǎo)]moesin磷酸化,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的改變,進(jìn)而引起血管通透性增高。2.S1PR2/3介導(dǎo)了高濃度S1P對(duì)內(nèi)皮屏障功能的破壞作用。本研究試圖探討高濃度S1P通過S1PR2/3,是否可以介導(dǎo)1moesin蛋白的蘇氨酸磷酸化,從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能障礙,為進(jìn)一步闡明高濃度S1P介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能損傷的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為防治血管通透性增加提供新的思路和有效的手段。 方法 本課題以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC為研究對(duì)象,應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫印跡、siRNA干擾、跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TEER)測(cè)定等方法,通過觀察高濃度S1P刺激下moesin蛋白表達(dá)和磷酸化水平的變化,及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞骨架形態(tài)、屏障功能的影響,闡明moesin在高濃度S1P介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能變化中的作用。 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿、微孔小皿(Petri dish)和鋪有1%明膠的雙層通透的培養(yǎng)皿(transwell)頂層小室微孔膜上(直徑6.5mm,孔徑大小0.4μm),待細(xì)胞長(zhǎng)至融合后,換無(wú)血清培養(yǎng)基8h使細(xì)胞獲得同步生長(zhǎng)。用濃度為10μmol/L的S1P與細(xì)胞共同培養(yǎng)不同時(shí)間,并設(shè)立空白對(duì)照組。在各實(shí)驗(yàn)處理組中,分別用可溶性S1PR1拮抗劑(W146)、S1PR2拮抗劑(JTE-013)、S1PR3拮抗劑(CAY10444)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞；或用moesin siRNA預(yù)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,并設(shè)立陰性對(duì)照組進(jìn)行比較,均繼以S1P培養(yǎng)20min。 結(jié)果 1.S1P以時(shí)間依賴和劑量依賴的方式介導(dǎo)HUVECs moesin磷酸化 在相同的濃度(10μmol/L SIP), SIP以時(shí)間依賴的方式引起moesin磷酸化,并在20min內(nèi),各濃度的S1P都能以時(shí)間依賴的方式引起1moesin磷酸化,而在20mmin后,高濃度S1P介導(dǎo)的moesin磷酸化進(jìn)入一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的平臺(tái)期,90min后noesin磷酸化水平基本恢復(fù)。濃度梯度的S1P(0、0.5、1.0、5.0和10.0μmol/L)刺激HUVECs20min后,各濃度刺激組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.001),其中以10.0μmol/L刺激引起的moesin磷酸化水平最高。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：S1P以時(shí)間依賴和劑量依賴的方式介導(dǎo)HUVECs moesin磷酸化。 2.高濃度S1P通過S1PR2/3介導(dǎo)moesin磷酸化 S1PR1拮抗劑(W146)、S1PR2拮抗劑(JTE-013)、S1PR3拮抗劑(CAY10444)分別預(yù)處理HUVECs30min,再用高濃度S1P(10μmol/L)刺激20min后,結(jié)果證明W146和S1PR3拮抗劑(CAY10444)預(yù)處理組moesin磷酸化水平變化與S1P (10μmol/L)刺激組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而JTE-013預(yù)處理組加S1P(10μmol/L)刺激組的]moesin磷酸化較單純S1P (10μmol/L)刺激組明顯減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：高濃度S1P通過S1PR2介導(dǎo)moesin磷酸化。 3.下調(diào)moesin表達(dá)后可減輕高濃度S1P介導(dǎo)的屏障破壞作用 將HUVECs種植在35mm培養(yǎng)皿里,轉(zhuǎn)染lnoesin的siRNA干擾moesin的表達(dá),證明moesin的表達(dá)確實(shí)降低,用S1P (10μmol/L)刺激,moesin的磷酸化水平也隨之被降低。 在功能學(xué)方面,將HUVECs種植在transwell小室里,轉(zhuǎn)染,moesin的siRNA干擾moesin的表達(dá)后再用S1P(10μmol/L)刺激,測(cè)定90min內(nèi)跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻。S1P(10pmol/L)刺激組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組加S1P刺激后跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻明顯降低,在20min時(shí)變化最明顯(P0.001),提示內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能減弱；轉(zhuǎn)染moesin siRNA加S1P刺激組電阻變化幅度小,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),證明下調(diào)1moesin表達(dá)后會(huì)減少高濃度S1P介導(dǎo)的屏障破壞作用,提示moesin蛋白在高濃度S1P介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加中具有重要作用。 在形態(tài)學(xué)方面,將HUVECs種植在Petri dish里,轉(zhuǎn)染moesin siRNA干擾moesin的表達(dá)后,再用S1P (10μmol/L)刺激20min,經(jīng)過多聚甲醛固定、0.5%曲通打孔、5%BSA封閉后再孵育熒光F-actin抗體,PBS洗4次2min/次后觀察內(nèi)皮細(xì)胞F-actin形態(tài)變化。結(jié)果顯示,S1P組與對(duì)照組相比,應(yīng)力纖維形成明顯增加；與S1P組比較,下調(diào)moesin表達(dá)能顯著抑制高濃度S1P刺激組應(yīng)力纖維的形成,提示下調(diào)noesin表達(dá)后能改善高濃度S1P對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。以上結(jié)果證明:moesin磷酸化參與了高濃度S1P介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞屏障損傷作用。 結(jié)論 1.S1P以時(shí)間依賴和劑量依賴的方式介導(dǎo)HUVECs moesin磷酸化； 2.Moesin磷酸化通過S1PR2參與高濃度S1P介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能損傷作用； 3.Moesin磷酸化參與了高濃度S1P介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞屏障破壞作用。
【關(guān)鍵詞】：1-磷酸鞘胺醇 S1P受體 moesin 內(nèi)皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-25
• 材料與方法25-36
• 結(jié)果36-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 英文縮略詞55-57
• 碩士期間取得的成果57-58
• 致謝58-60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 程楊;何勉;;ERM蛋白的生物學(xué)功能及其與婦科腫瘤的聯(lián)系[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè);2006年05期

2 劉湘蘭;王占華;李強(qiáng);黃緒亮;黃巧冰;;1-磷酸鞘氨醇對(duì)燒傷后血管通透性的作用研究[J];中國(guó)微循環(huán);2008年05期

  本文關(guān)鍵詞：Moesin磷酸化在1-磷酸鞘氨醇介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：304743