本文關(guān)鍵詞：小鼠卵巢中生殖干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 性腺作為傳遞遺傳物質(zhì)的唯一組織，在睪丸中已經(jīng)證實(shí)有生殖系干細(xì)胞，即精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells, SSCs）的存在，并成功進(jìn)行了體外培養(yǎng)，通過生精過程產(chǎn)生精子[1]。但是，在卵巢中，雌性生殖干細(xì)胞的存在（female germlinestem cells,FGSCs）仍然有爭(zhēng)議。 傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為：卵母細(xì)胞的數(shù)量在出生后的數(shù)量是固定存在的，雌性哺乳動(dòng)物卵泡池中不存在一種能增殖的生殖細(xì)胞[2,3,4]。這一觀點(diǎn)持續(xù)了半個(gè)多世紀(jì)，然而，在2004年Johnson等[5]經(jīng)過測(cè)定小鼠不同天數(shù)未閉鎖卵泡數(shù)和閉鎖卵泡數(shù)，發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖的發(fā)生率要高于卵泡數(shù)量的減少率，，因此推測(cè)卵巢組織內(nèi)存在有增殖活性的生殖細(xì)胞，這一觀點(diǎn)打破了傳統(tǒng)觀的生殖細(xì)胞的理論。在其后，不同的學(xué)者紛紛利用不同的方法進(jìn)行反復(fù)的驗(yàn)證，其中最有意義的是Zou等[6]通過MVH標(biāo)記進(jìn)行磁珠分選，獲得的生殖細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其具有增殖的潛能，轉(zhuǎn)染GFP標(biāo)簽后原位移植生殖細(xì)胞毀損鼠，與雄性交配后產(chǎn)下正常的轉(zhuǎn)基因GFP小鼠。White等[7]成功通過流式細(xì)胞(FACS)分選小鼠和人類的GSCs，又通過GFP標(biāo)記GSCs，移植至小鼠卵巢內(nèi)，獲得GFP陽(yáng)性的卵母細(xì)胞。然而有些學(xué)者仍然堅(jiān)持著傳統(tǒng)的觀點(diǎn)，Zhang H等[8]通過內(nèi)源性的基因的方法和多種熒光Rosa26，Ddx4-Cre體外追蹤生殖干細(xì)胞的方法，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)表達(dá)Ddx4有增殖活性的生殖細(xì)胞。 因此，卵巢組織內(nèi)是否存在FGSCs，仍然存在著巨大的爭(zhēng)議。本研究試圖通過定位小鼠卵巢內(nèi)增殖的生殖細(xì)胞，再聯(lián)合膠原酶和胰酶消化卵巢及利用差異貼壁法進(jìn)行細(xì)胞的分離純化，采用與SSCs相似的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞，并利用卵泡液的性質(zhì)尋找FGSCs的分化能力，并鑒定其生物學(xué)特性。 目的 分離、培養(yǎng)、鑒定卵巢中的雌性生殖干細(xì)胞，并進(jìn)一步探討其分化能力，為生殖干細(xì)胞的存在提供證據(jù)。 方法 1）利用Brdu和MVH雙標(biāo)免疫熒光定位體內(nèi)具有增殖活性的生殖細(xì)胞； 2）取2~5d新生鼠卵巢組織，膠原酶、胰蛋白酶聯(lián)合消化獲得單個(gè)細(xì)胞懸液，取12.5d孕鼠的胎鼠獲得胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），以5×104個(gè)/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，做為飼養(yǎng)細(xì)胞，添加不同生長(zhǎng)因子的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)； 3）免疫熒光及組化檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)記物Oct4、SSEA-1，生殖細(xì)胞標(biāo)記物MVH，Brdu-MVH雙標(biāo)的表達(dá)； 4）向處于減數(shù)分裂時(shí)的細(xì)胞中添加人卵泡液，觀察細(xì)胞的分化形態(tài)；并鑒定其分化功能； 5）RT-PCR檢測(cè)生殖細(xì)胞MVH，Dazl，透明帶基因Zp1、Zp2、Zp3的表達(dá)，干細(xì)胞基因Oct4，聯(lián)會(huì)復(fù)合體基因SCP3的表達(dá)。 結(jié)果 1）卵巢上皮存在著Brdu/MVH雙標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞； 2）體外分離培養(yǎng)2d形成散在的小而圓形或卵圓形的細(xì)胞，多數(shù)處于分裂狀態(tài)，隨著培養(yǎng)的延長(zhǎng)細(xì)胞聚集成簇； 3）免疫組化及熒光顯示SSEA-1，Oct4和Brdu/MVH雙標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性，堿性磷酸酶染色陽(yáng)性； 4）誘導(dǎo)分化后，SCP3表達(dá)，RT-PCR顯示Oct4表達(dá)降低，MVH，Dazl，ZP1，ZP2，ZP3表達(dá)升高。 結(jié)論 小鼠卵巢組織中存在FGSCs，在體外能夠成功培養(yǎng)，且可誘導(dǎo)分化為卵母細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：生殖干細(xì)胞 卵巢 培養(yǎng) 鑒定 分化
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R321
【目錄】：

• 英文縮略表（abbreviations）5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 1.前言12-15
• 2 材料與方法15-25
• 3.結(jié)果25-31
• 4.討論31-37
• 5 結(jié)論37
• 參考文獻(xiàn)37-42
• 附錄42-44
• 致謝44-46
• 綜述46-54
• 參考文獻(xiàn)52-54

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉然;馮定慶;宣恒華;凌斌;;新生鼠卵巢中卵泡膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年05期

  本文關(guān)鍵詞：小鼠卵巢中生殖干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：303035