本文關(guān)鍵詞：成體肝間充質(zhì)樣干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與體外成肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的 理想的肝細(xì)胞材料是進(jìn)行藥物檢測(cè)、肝細(xì)胞移植治療以及生物人工肝等應(yīng)用的基礎(chǔ)。但由于新鮮肝細(xì)胞來源匱乏,成熟肝細(xì)胞無法在體外增殖且體外培養(yǎng)易喪失其分化狀態(tài)等問題,尋找可供應(yīng)用的肝細(xì)胞材料成為多年來科學(xué)家們致力解決的難題。 除成熟原代肝細(xì)胞外,應(yīng)用較多的傳統(tǒng)肝細(xì)胞源主要是腫瘤來源永生化細(xì)胞系、胚胎干細(xì)胞(ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)。其中,各種腫瘤來源的永生化細(xì)胞系具有增殖迅速、可以冷凍儲(chǔ)存并無限傳代的特性,但腫瘤源性細(xì)胞以及各種通過基因工程技術(shù)加工的細(xì)胞系,存在潛在的致瘤危險(xiǎn),較低的安全系數(shù)限制了其在臨床中的應(yīng)用。ESCs為具有全能性及無限增殖能力的原始細(xì)胞群,但其來源受限,一直存在著一定的倫理學(xué)爭(zhēng)議,加之培養(yǎng)費(fèi)用高昂,細(xì)胞分化狀態(tài)不穩(wěn)定,使其難以大規(guī)模應(yīng)用。iPSCs是通過基因工程技術(shù)將體細(xì)胞重構(gòu)得到的誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞；但同ESCs一樣,其致畸胎瘤形成的潛在可能性成為制約其臨床應(yīng)用的主要障礙。據(jù)FDA報(bào)道,畸胎瘤形成的安全隱患,成為制約干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的主要障礙。 近年來,許多學(xué)者開始了對(duì)成體干細(xì)胞(ASC)的研究。ASC是存在于人和動(dòng)物已分化組織中的具有自我更新和增殖能力以及(多向)分化潛能的細(xì)胞。ASC通常處于靜息狀態(tài),在適當(dāng)?shù)臈l件下,可激活并向特定組織器官分化；ASC的獲取與分離倫理學(xué)爭(zhēng)議少、且為正常細(xì)胞來源,未經(jīng)過基因改造,安全性高[2]。目前研究較多的為骨髓造血干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、以及脂肪干細(xì)胞等。研究顯示,骨髓造血干細(xì)胞可經(jīng)體外誘導(dǎo)分化成為具有某些肝細(xì)胞特異性功能的肝樣細(xì)胞,但其誘導(dǎo)效率仍然較低,分化后形成的肝樣細(xì)胞功能低下[3-5]。 由于以上細(xì)胞依然無法提供理想的肝細(xì)胞來源,近年來,有學(xué)者開始尋找是否存在肝臟來源的成體干細(xì)胞。有研究報(bào)道成功從受損的大鼠肝臟(如重度肝纖維化或是慢性腫瘤)成功分離出干細(xì)胞樣具有體外分裂能力的細(xì)胞；也有研究報(bào)道健康大鼠成熟肝細(xì)胞可在體外去分化形成祖細(xì)胞[6]。 在既往研究基礎(chǔ)上,本研究旨在尋找一種更為安全可靠、且特異性功能好的肝細(xì)胞源。實(shí)驗(yàn)致力于從健康成年大鼠肝臟中分離出成體肝間充質(zhì)樣干細(xì)胞(簡(jiǎn)稱成體肝干細(xì)胞,r-LMSC),進(jìn)一步對(duì)rALMSC進(jìn)行體外成肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化,并對(duì)分化后形成的肝樣細(xì)胞(rALMSC--H)進(jìn)行生物學(xué)特性、代謝功能的檢測(cè)與評(píng)價(jià),并使用rALMSC-H對(duì)肝細(xì)胞毒性藥物進(jìn)行藥物測(cè)試,以評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。 方法 1、成體肝間充質(zhì)樣干細(xì)胞(rALMSC)的分離與培養(yǎng)。使用含有10%胚胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)原代肝細(xì)胞,直至成體肝干細(xì)胞開始生長(zhǎng)并增殖；當(dāng)成體肝干細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶90%面積時(shí),將細(xì)胞用0.25%的胰酶進(jìn)行消化、傳代。 2.rALMSC的鑒定。使用細(xì)胞免疫熒光對(duì)細(xì)胞性質(zhì)進(jìn)行鑒定,鑒定細(xì)胞是否表達(dá)VIM、α-SMA.進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)rALMSC細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定,鑒定標(biāo)志包括間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD29、CD44、CD90,造血干細(xì)胞標(biāo)志CD45,以及肝細(xì)胞特異性標(biāo)志ASGPR. 3、體外誘導(dǎo)成體肝干細(xì)胞(rALMSC)向肝細(xì)胞的分化。誘導(dǎo)分化共分為三個(gè)階段：預(yù)分化階段、誘導(dǎo)分化階段以及誘導(dǎo)成熟階段。預(yù)分化階段使用EGF、FGF-4培養(yǎng)2天,分化階段使用FGF-4、HGF培養(yǎng)7天,成熟階段使用HGF、OSM培養(yǎng)7天。 4、分化后肝樣細(xì)胞(rALMSC-H)形態(tài)學(xué)及生物學(xué)功能的檢測(cè)。在倒置相差顯微鏡下觀察rALMSC分化至rALMSC-H的形態(tài)學(xué)變化；使用細(xì)胞免疫熒光鑒定分化后rALMSC-H是否表達(dá)ALB；采用qRT-PCR法檢測(cè)rALMSC-H的肝細(xì)胞特異性功能及相關(guān)蛋白的基因表達(dá)情況；使用Urea Nitrogen Kit檢測(cè)rALMSC-H培養(yǎng)上清尿素氮分泌情況；使用液相色譜-質(zhì)譜分析儀對(duì)分化前rALMSC、分化后rALMSC-H以及新鮮成熟大鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行分析,檢測(cè)其細(xì)胞色數(shù)P450(CYP1A2)活性。 5、使用rALMSC-H進(jìn)行藥物誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性測(cè)試。使用不同濃度撲熱息痛、雙氯芬酸、酮康唑、氯丙嗪、奎尼丁以及氟他胺作用于rALMSC-H以及成熟肝細(xì)胞,24小時(shí)后運(yùn)用MTS檢測(cè)細(xì)胞活性,并進(jìn)行比較。 6、統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件,組間差異采用兩樣本的t檢驗(yàn),P0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、成體肝干細(xì)胞(rALMSC)的分離與培養(yǎng)。分離獲得典型梭形或紡錘形的間充質(zhì)樣rALMSC,細(xì)胞可在體外快速增殖、傳代。第三代后,為純化的rALMSC。 2、rALMSC的鑒定。rALMSC表達(dá)VIM及α-SMA;間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD44、CD90陽(yáng)性,肝細(xì)胞表面標(biāo)記物ASGPR及造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45陰性。 3、分化后rALMSC-H形態(tài)學(xué)變化。rALMSC在體外被誘導(dǎo)向肝細(xì)胞分化過程中,逐漸失去其原有長(zhǎng)梭形形態(tài),轉(zhuǎn)變成肝細(xì)胞樣明顯的多邊形或立方體形,核仁橢圓,形態(tài)一致,邊界清晰。 4、qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物及功能蛋白基因水平的表達(dá),顯示誘導(dǎo)分化后rALMSC-H表達(dá)ALB、HNF-4α、CYP1A2、CYP2B2以及CYP3A2,其中ALB、CYP1A2、以及CYP3A2表達(dá)水平顯著高于未分化的rALMSC。HNF-4α以及CYP2B2表達(dá)水平均有升高,且接近原代成熟肝細(xì)胞表達(dá)水平,但分化前后表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5、誘導(dǎo)分化后的rALMSC-H肝臟特異性功能鑒定。免疫熒光結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化后的rALMSC-H胞漿內(nèi)白蛋白陽(yáng)性。上清檢測(cè)rALMSC與rALMSC-H均具有合成尿素氮的能力,體外誘導(dǎo)分化使rALMSC-H合成尿素能力顯著高于rALMSC。液相色譜-質(zhì)譜分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示,分化前rALMSC具有微弱的細(xì)胞色素P450(CYP1A2)活性,分化后rALMSC-H細(xì)胞色素P450(CYP1A2)活性顯著增加。 6、藥物誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示撲熱息痛、雙氯芬酸、酮康唑、氯丙嗪、奎尼丁、氟他胺均對(duì)分化后rALMSC-H具有細(xì)胞毒性,且趨勢(shì)與原代肝細(xì)胞一致,但rALMSC-H對(duì)各藥物敏感性不一。其中,rALMSC-H對(duì)氯丙嗪、酮康唑、氟他胺的敏感性與原代肝細(xì)胞幾乎一致；對(duì)撲熱息痛、雙氯芬酸、奎尼丁的敏感性較原代肝細(xì)胞略低。 結(jié)論 本研究成功從成年健康大鼠肝臟中分離出具有典型間充質(zhì)干細(xì)胞特性的成體肝干細(xì)胞(rALMSC), rALMSC來源于非腫瘤組織,其分離過程不涉及轉(zhuǎn)染等基因工程技術(shù),安全性高。rALMSC經(jīng)過體外生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分化后,可形成具有肝臟特異性功能的肝樣細(xì)胞(rALMSC-H)、rALMSC-H可表達(dá)ALB、HNF4、CYP1A2、 CYP2B2、CYP3A2,具有合成白蛋白、尿素的能力和細(xì)胞色素P450活性,并能代謝肝毒性藥物,具有作為藥物檢測(cè)用細(xì)胞的潛能,為解決肝細(xì)胞來源問題提供了一種新的方法。
【關(guān)鍵詞】：成體肝干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞 誘導(dǎo)分化 肝細(xì)胞 藥物檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-17
• 材料和方法17-36
• 1. 材料和試劑17-21
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法21-35
• 3. 統(tǒng)計(jì)分析35-36
• 結(jié)果36-46
• 討論46-52
• 全文小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 附錄59-71
• 縮寫詞簡(jiǎn)表71-72
• 攻讀碩士學(xué)位期間的成果72-73
• 致謝73-74

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 AmrAmin;AlaaEldinA.Hamza;;Effects of Roselle and Ginger on cisplatin-induced reproductive toxicity in rats[J];Asian Journal of Andrology;2006年05期

2 Raquel Taléns-Visconti;Ana Bonora;Ramiro Jover;Vicente Mirabet;Francisco Carbonell;José Vicente Castell;María José Gómez-Lechón;;Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2006年36期

  本文關(guān)鍵詞：成體肝間充質(zhì)樣干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與體外成肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：301340