本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)與帕金森病細(xì)胞模型的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),又稱為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,是一種存在于骨髓中的成體干細(xì)胞,具有向肌肉、骨骼、神經(jīng)等多個(gè)方向分化的潛能。有研究表明,可以利用BMSCs腦內(nèi)移植治療帕金森病(PD)等神經(jīng)退行性疾病。據(jù)推測,這種治療作用可能是通過BMSCs在腦內(nèi)向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,從而替代損傷的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮作用而實(shí)現(xiàn)。但BMSCs定向分化規(guī)律尚缺乏系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。本研究通過BMSCs的體外擴(kuò)增,并進(jìn)行向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo),通過檢測神經(jīng)元樣細(xì)胞特異性標(biāo)記等研究,探索BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的規(guī)律和移植治療諸如帕金森等神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制,為該類疾病的細(xì)胞及其基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 帕金森病是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元變性、凋亡和包涵體的產(chǎn)生為主要病理特征的神經(jīng)退行性疾病。目前,利用動(dòng)物模型研究帕金森病的實(shí)驗(yàn),主要在整體水平觀察帕金森病的行為學(xué)改變及組織學(xué)上的病理特征,較難深入掌握其發(fā)病的細(xì)胞學(xué)和分子學(xué)機(jī)制,在一定程度上制約了藥物治療等控制措施的研究進(jìn)展。而成功的構(gòu)建帕金森病細(xì)胞模型可以彌補(bǔ)上述不足。帕金森病細(xì)胞模型的成功要求細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和產(chǎn)生包涵體即(Lewy小體)。帕金森病細(xì)胞模型可以從細(xì)胞水平方面研究細(xì)胞各個(gè)指標(biāo)的變化。本實(shí)驗(yàn)建立帕金森病體外細(xì)胞模型,模擬人類帕金森病的兩大病理特征,深入地研究帕金森病分了水平上的各項(xiàng)變化,為移植治療藥物篩選提供技術(shù)平臺。 帕金森病細(xì)胞模型從細(xì)胞水平上探討帕金森病的發(fā)病機(jī)制,研究細(xì)胞生物學(xué)特性的變化,對于帕金森病動(dòng)物模型中的神經(jīng)細(xì)胞,細(xì)胞水平上的發(fā)病機(jī)制具有啟示作用。BMSCs移植治療帕金森病在細(xì)胞水平上的機(jī)理研究與帕金森病細(xì)胞模型相關(guān),為今后的移植治療與藥物治療奠定一定的基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)一：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究 體外分離純化的大鼠BMSCs,通過定向誘導(dǎo)技術(shù),掌握其分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的條件和變化規(guī)律,為BMSCs移植治療神經(jīng)退行性疾病的技術(shù)程序及作用機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。以全骨髓沖洗法獲得大鼠BMSCs;將獲得的BMSCs,接種全骨髓培養(yǎng)；貼壁培養(yǎng)法純化BMSCs; BMSCs傳代消化,繪制細(xì)胞的生長曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面特異因了；誘導(dǎo)劑誘導(dǎo),對BMSCs進(jìn)行向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo),通過顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,并以免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測被誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)元特異性標(biāo)志nestin、NSE和GFAP的表達(dá),驗(yàn)證BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能。以全骨髓貼壁法純化培養(yǎng)的BMSCs,貼壁生長良好,傳代后,BMSCs生長曲線為S形；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面特異因子陽性表達(dá)率很高,符合BMSCs表面抗原的特征；細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞的nestin和NSE陽性,GFAP陰性,說明體外誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,不表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白,提示在體外被誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元樣細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。體外分離純化的BMSCs,細(xì)胞表面標(biāo)志符合BMSCs特征,提示貼壁培養(yǎng)法可以獲得高純度的BMSCs。在一定的條件下,BMSCs在體外可以被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,說明BMSCs具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能,提示BMSCs有替代神經(jīng)細(xì)胞移植治療帕金森病的可能。 實(shí)驗(yàn)二：帕金森病細(xì)胞模型的建立 以PC12細(xì)胞為對象,經(jīng)適當(dāng)處理,建立可用作帕金森病相關(guān)研究的PD細(xì)胞模型。建立PC12細(xì)胞穩(wěn)定的培養(yǎng)體系,繪制細(xì)胞生長曲線；不同濃度的MPP+處理PC12細(xì)胞,比較不同濃度的MPP+對PC12細(xì)胞活力的影響,選擇最適宜的MPP+濃度；以細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和特異性蛋白a-synuclein為指標(biāo),檢測PD細(xì)胞模型的構(gòu)建情況。以MTT法檢測細(xì)胞活力,以Hoechst33342熒光染色觀察細(xì)胞凋亡,通過AO和EB染色法檢測細(xì)胞凋亡率,免疫熒光染色法檢測特異性蛋白a-synuclein勺存在。培養(yǎng)體系穩(wěn)定、操作簡單,細(xì)胞貼壁迅速,活力較高,細(xì)胞生長曲線呈S形。不同濃度的MPP+對PC12細(xì)胞的影響不同,隨著MPP+濃度的增加,PC12細(xì)胞活力降低,當(dāng)MPP+濃度高于500μM時(shí),PC12細(xì)胞活力不再顯著降低。Hoechst33342熒光染色觀察凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)色的熒光碎片；AO和EB染色法可觀察到明顯的細(xì)胞凋亡,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率達(dá)明顯高于對照組。經(jīng)處理的PC12細(xì)胞表達(dá)特異性蛋白a-synuclein。 MPP+處理PC12細(xì)胞,細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡和包涵體出現(xiàn)的PD兩大病理特征,同時(shí)還表達(dá)PD特有的a-synuclein蛋白。說明本實(shí)驗(yàn)成功建立了PD細(xì)胞模型。
【關(guān)鍵詞】：大鼠 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs) 神經(jīng)元樣細(xì)胞 PC12細(xì)胞 PD細(xì)胞模型
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5;R-332
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 符號說明9-10
• 文獻(xiàn)綜述10-20
• 第一章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的體外研究進(jìn)展10-13
• 1 BMSCs概況10
• 2 BMSCs的特性10-12
• 3 BMSCs的應(yīng)用前景12-13
• 第二章 帕金森病細(xì)胞模型建立的研究近況13-16
• 1 PD體外細(xì)胞模型常用的細(xì)胞14-15
• 2 PD體外細(xì)胞模型類型15
• 3 PD體外細(xì)胞模型的相關(guān)實(shí)驗(yàn)15-16
• 參考文獻(xiàn)16-20
• 第一章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)20-31
• 1 材料20-22
• 2 方法22-24
• 3 結(jié)果24-29
• 4 討論29-31
• 第二章 帕金森病細(xì)胞模型的建立31-45
• 1 材料31-33
• 2 方法33-37
• 3 結(jié)果37-42
• 4 討論42-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 致謝48-49
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄49-50

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 常宏;蔣紹艷;史玉朋;宋丹妮;;丹參注射液誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究[J];中國藥房;2008年30期

2 陳生弟,王剛;帕金森病的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J];中華老年醫(yī)學(xué)雜志;2004年07期

  本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)與帕金森病細(xì)胞模型的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：298336