蛋白質(zhì)幾乎參與所有的生物學(xué)過(guò)程。他們通過(guò)與其他蛋白質(zhì)或者其他分子發(fā)生相互作用行使功能。本論文建立了兩個(gè)研究蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)新策略：4Facts策略用于鑒定實(shí)時(shí)的蛋白質(zhì)-配體相互作用；4S策略用于整體分析蛋白質(zhì)-細(xì)胞相互作用。4Facts策略——快速固定（Fast Fix）、親和捕獲（Fish）、分子量篩選（Filter）,可以在不對(duì)生物學(xué)樣品進(jìn)行預(yù)先干預(yù)的條件下全面、靈敏而準(zhǔn)確地研究實(shí)時(shí)原位的蛋白質(zhì)-配體相互作用。在本策略中,SDS-PAGE （十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）被用于打斷非共價(jià)結(jié)合以去除未被共價(jià)交聯(lián)的復(fù)合物,以及提供分子量信息用于篩選配體蛋白。候選蛋白被認(rèn)定為靶蛋白的配體蛋白,需要同時(shí)滿足以下三個(gè)條件：第一,必須與靶蛋白在同一膠條中被鑒定；第二,必須在實(shí)驗(yàn)組膠條中被鑒定,而不出現(xiàn)在相同、相鄰或更高分子量范圍的對(duì)照組膠條中；第三,所在膠條的分子量范圍包含或大于它與靶蛋白的理論分子量之和。我們將4Facts策略應(yīng)用于人血液中的蛋白質(zhì)-配體相互作用,以血漿白蛋白以及轉(zhuǎn)鐵蛋白為例展示該策略的可行性。人血液不經(jīng)任何處理被直接加入10%的甲醛溶液中進(jìn)行5秒的快速交聯(lián)反應(yīng)... 

【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：134 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

Facts策略技術(shù)路線（T:紀(jì)蛋白）

免疫印跡實(shí)驗(yàn)。如圖3B,單個(gè)白蛋白為主要的顯色條帶，在各個(gè)交聯(lián)條件中的量基本相等。0 %甲酸鮮育的未交聯(lián)樣品在單個(gè)白蛋白的分子量以外，更高的分子量區(qū)域無(wú)焚光信號(hào)。0 S交聯(lián)樣品在高分子量區(qū)幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)（極弱的信號(hào)可能由白蛋白量大有拖尾而產(chǎn)生）。其余交聯(lián)條件均在比白蛋白單個(gè)分子的分子量高的區(qū)域有彌散，并且在70-100 kDa、130-I80 kDa之間有條帶。與一維變性凝膠相對(duì)應(yīng)：1 %甲酸交聯(lián)的樣品條帶最淺，可能是受到甲酸的量的限制；20 %及40 %甲醛交聯(lián)樣品中70-100 kDa間的條帶信號(hào)強(qiáng)，但更高分子量處未見(jiàn)彌散增加；甲酸濃度10%之下交聯(lián)產(chǎn)物的量沒(méi)有隨著交聯(lián)時(shí)間的增加而增加。結(jié)果說(shuō)明：交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生迅速，5秒交聯(lián)時(shí)間足夠；10%的甲醛濃度合適，增加濃度沒(méi)有明顯增加交聯(lián)產(chǎn)物；白蛋白大多數(shù)以單個(gè)分子的形式存在。3.1.2.5小結(jié)及討論交聯(lián)產(chǎn)物的多少取決于樣品本身存在的蛋白質(zhì)-配體相互作用的量

我們將白蛋白免疫沉淀和凝膠電泳之后70 kDa以下的凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組70 kDa左右有明顯條帶，為白蛋白的條帶，70 kDa以下的明顯條帶為抗體重鏈，表面抗體成功地將白蛋白捕獲下來(lái)，且白蛋白及抗體均不過(guò)載量。而對(duì)照組在相應(yīng)的白蛋白及抗體重鏈處僅有極其微弱的條帶，PBS洗漆條件太弱，可能存在極少量的非特異性結(jié)合。3.1.3.3質(zhì)譜鑒定(1)候選的白蛋白配體實(shí)驗(yàn)組為交聯(lián)樣品加白蛋白抗體進(jìn)行免疫沉淀，對(duì)照組為交聯(lián)樣品不加抗體進(jìn)行相同操作。免疫沉淀之后的樣品在梯度膠中進(jìn)行SDS-PAGE分離。不經(jīng)過(guò)染色，70 kDa以上的全部凝膠區(qū)域被按照分子量切為六部分：70-100 kDa, 100-130 kDa,130-180 kDa, 180-250 kDa


本文編號(hào)：2969361