目的:建立三丁基氯化錫（TBTC）誘導的新生雌性大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞凋亡模型,并探討相關機制。方法:取新生24 h以內(nèi)的雌性SD大鼠,分離下丘腦神經(jīng)元細胞進行原代培養(yǎng)。免疫熒光染色法鑒定下丘腦神經(jīng)元純度后,分別暴露于含不同濃度TBTC（0、100、150、200、250、300μg/L）的培養(yǎng)基中。孵育24 h后,CCK-8檢測各組細胞存活率,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況,Hoechst 33258染色觀察凋亡細胞核形態(tài),透射電鏡觀察細胞形態(tài)的改變,Western blot檢測凋亡相關蛋白JNK、p-JNK的表達。結果:免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元純度約為92.23%。與TBTC 0μg/L組相比,各濃度TBTC干預24 h對下丘腦神經(jīng)元細胞的生長均有抑制作用,其相對存活率均顯著降低（P<0.01）,且呈濃度依賴性;與TBTC 0μg/L組相比,不同濃度的TBTC作用24 h后,下丘腦神經(jīng)元細胞均出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡,其細胞凋亡率均顯著升高（P<0.01）,且呈濃度依賴性。Hoechst 33258染色顯示,TBTC 150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細胞核呈致密濃染的高強度藍色熒... 

【文章來源】：上海中醫(yī)藥大學學報. 2019,33(04)

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免疫熒光染色鑒定下丘腦神經(jīng)元細胞(×200)2．2TBTC對下丘腦神經(jīng)元細胞增殖的影響與

上海中醫(yī)藥大學學報第33卷第4期2019年7月GFAP標記的神經(jīng)膠質(zhì)細胞呈紅色熒光;490nm藍色光激發(fā)β-tubulinⅢ標記的胞漿和突觸呈綠色熒光;390nm紫外光激發(fā)DAPI標記的細胞核呈藍色熒光;后兩者融合即為神經(jīng)元細胞。見圖1。免疫染色的細胞形態(tài)與熒光倒置顯微鏡下觀察一致。隨機選取10個視野計數(shù)，測得神經(jīng)元純度約為92．23%。圖1免疫熒光染色鑒定下丘腦神經(jīng)元細胞(×200)2．2TBTC對下丘腦神經(jīng)元細胞增殖的影響與TBTC0μg/L組比較，各濃度TBTC干預24h對下丘腦神經(jīng)元細胞的生長均有抑制作用，其相對存活率均顯著降低(P＜0．01)，且呈濃度依賴性。其中，150μg/LTBTC作用24h，下丘腦神經(jīng)元細胞增殖抑制率為(44．7±4．5)%。見圖2。2．3TBTC對下丘腦神經(jīng)元細胞凋亡的影響與TBTC0μg/L組比較，不同濃度的TBTC作用24h后，下丘腦神經(jīng)元細胞均出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡，其細胞凋亡率均顯著升高(P＜0．01)，且呈濃度依賴性。其中，150μg/LTBTC作用24h，下丘腦神經(jīng)元細胞的凋亡率為(42．6±6．6)%。綜合細胞增殖與細胞凋亡的實驗結果，選取TBTC150μg/L作為誘與TBTC0μg/L組比較，＊＊P＜0．01圖2TBTC各濃度組下丘腦神經(jīng)元細胞存活率(n=6，x－±s)導下丘腦神經(jīng)元細胞凋亡模型的藥物濃度進行后續(xù)實驗。見圖3、圖4。圖3TBTC各濃度組下丘腦神經(jīng)元細胞凋亡情況·75·

AcademicJournalofShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicineVol．33No．4Jul．2019與TBTC0μg/L組比較，＊＊P＜0．01圖4TBTC各濃度組下丘腦神經(jīng)元細胞凋亡率(n=3，x－±s)Hoechst33258染色后，TBTC0μg/L組下丘腦神經(jīng)元細胞的細胞核呈現(xiàn)均勻分布的低強度藍色熒光。與TBTC0μg/L組相比，TBTC150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細胞呈致密濃染的高強度藍色熒光，細胞核出現(xiàn)固縮態(tài)和顆粒狀改變，可見明顯的凋亡形態(tài)。見圖5。2．4TBTC對下丘腦神經(jīng)元細胞形態(tài)的影響透射電鏡觀察顯示，TBTC0μg/L組細胞形態(tài)規(guī)則，細胞圖5TBTC0μg/L及150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細胞形態(tài)(Hoechst33258染色，×500)膜飽滿，雙層核膜完整，細胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布;TBTC150μg/L組細胞與周圍細胞脫離，細胞核固縮并發(fā)生裂解，染色質(zhì)邊集化呈“新月狀”，細胞膜內(nèi)陷或出芽形成小泡，將細胞分割成多個有膜包繞的凋亡小體。見圖6。2．5TBTC對下丘腦神經(jīng)元細胞JNK表達的影響與TBTC0μg/L組相比，TBTC150μg/L組p-JNK蛋白表達顯著增多，p-JNK/JNK蛋白表達比值顯著上調(diào)(P＜0．01)。見圖7。圖6TBTC0μg/L及150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細胞形態(tài)(透射電鏡)與TBTC0μg/L組比較，＊＊P＜0．01圖7TBTC0μg/L及150μg/L組下丘腦神經(jīng)元細胞JNK表達(n=3，x－±s)·85·

【參考文獻】：
期刊論文
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