特異性免疫應(yīng)答依賴于T淋巴細胞，而胸腺是T淋巴細胞發(fā)育和分化的重要場所。T細胞的前體細胞從骨髓遷移至胸腺，在胸腺經(jīng)歷了陰性選擇和陽性選擇，最終只有5％的T細胞發(fā)育成熟并輸出到外周淋巴器官發(fā)揮免疫應(yīng)答功能。對于免疫系統(tǒng)而言，胸腺處于十分重要的地位，在機體衰老過程中，胸腺比其它器官表現(xiàn)出更明顯的增齡性改變—退化（萎縮）。我們推測這一過程必然與其它代謝過程一樣受控于遺傳，伴隨眾多基因的參與。然而，迄今為止我們對其基因調(diào)控機制還所知甚少。因此，從胸腺中尋找與衰老相關(guān)的未知或已知基因，并探討它們在T淋巴細胞分化發(fā)育及衰老過程中的作用將有助于深入闡明老化免疫的機制。 為了尋找增齡相關(guān)性胸腺基因，本研究采用了以下研究策略與路線：首先，采用差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（DDRT-PCR）對1月和10月齡小鼠胸腺mRNA的差異表達情況進行了分析；其次，以基因的差異片段（EST，expressed sequence tag）進行Northern雜交以鑒別其假陽性；再次，綜合運用EST篩選cDNA文庫、cDNA末端快速擴增（RACE）、EST拼接結(jié)合RT—PCR等實驗技術(shù)克隆差異片段所代表的全長基因；隨之... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

回收差異產(chǎn)物的再擴增..一eoe

Balb/c小鼠胸腺mRNA的DDRT一PCR分析道為l月齡小鼠胸腺mRNA;第2、4、6、異基因的表達:刁卜:顯示同一基因的表sisofrexPressionofmRNArfoml一or10一momRNArforn10一montholdmiee;LaneZ，4，6，8.一卜rePresentsuniquemRNAexPressionds允:di價rentIeve一ofidentiea[thymiem

記后作為探針，以日一actni為內(nèi)對照，分別與1月和10月齡小鼠胸腺總RNA進行Northem雜交。根據(jù)放射自顯影的所顯示的雜交信號強弱，判定31個探針為陽性。同時根據(jù)陽性信號的位置，亦可大致判斷轉(zhuǎn)錄本的大小。圖1.4是其中部分的六雜交結(jié)果。一aCtin圖1.4差異顯示DNA片段sh38、sh6、sh13、sh97與1和10月齡小鼠胸腺總RNA的Northern印跡雜交結(jié)果.(A、B、C、D:10月齡小鼠胸腺TotalRNA:a、b、e、d:l月齡小鼠胸腺TotalRNA齡小鼠胸腺TotalRNA)Fig1.4NorthernblothybridizationofdifferentialdisplayDNAfragmentsh38，sh6，sh13andsh97withthymistotalRNAderivedfroml一or10一monthmieeresPeetively.LaneA、B、C、D:thymusfrom10一monthmouse:Lanea、b、e、d:thymusfroml一monthmouse產(chǎn).23差異片段亞克隆及測序由于PCR擴增中TaqDNA聚合酶往往會在PCR產(chǎn)物的3’端加上一個A，可以與pGEM一Taeys載體上的T相連，連接產(chǎn)物可轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHS。。通過藍白斑篩選，挑出白色克隆，小提質(zhì)粒，用EocRI內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定。電泳鑒定結(jié)果見圖1.5。對含有插入片段的重組質(zhì)粒，進行測序。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]綠色熒光蛋白及其應(yīng)用[J]. 張峰,任燕,陸長德.  生命科學. 1999(02)



本文編號：2954359