心肌損傷可由病毒、細(xì)菌等感染,導(dǎo)致的心肌炎或化學(xué)藥物的毒性作用等多種因素所介導(dǎo),嚴(yán)重影響人類的健康。本論文涉及對阿霉素和牙齦卟啉菌兩類心臟毒性誘因的十預(yù)性研究,旨在趨利避害,從源頭上預(yù)防兩類因素對心臟造成的病理性損傷。阿霉素,是一種作用于DNA的葸環(huán)類抗生素,廣泛應(yīng)用于臨床抗腫瘤的藥物。阿霉素的應(yīng)用帶來多方面的副作用,包括惡心、嘔吐和心律不齊等。其中當(dāng)累積劑量達(dá)至（?）55mg/m2（?）（?）,能夠引起充血性心衰、擴(kuò)張性心肌病甚至死亡,從而限制了其臨床應(yīng)用。迄今為止,阿霉素的急性和累積性心臟毒性的機(jī)制尚未完全清楚,更無預(yù)防和治療阿霉素誘導(dǎo)心肌病行之有效的措施。Calpain,即鈣蛋白酶,屬于鈣離子依賴的半胱氨酸蛋白酶家族,廣泛表達(dá)于哺乳動物以及多種其他生物。人類已鑒定的15種亞型的分布、結(jié)構(gòu)和功能均有明顯差異。其中“-calpain（calpain-1）和m-calpain（calpain-2）為普遍存在且研究深入。Calpain的激活參與機(jī)體多系統(tǒng)疾病,如糖尿病、阿爾滋海默氏病、動脈粥樣硬化以及胃癌等。前期研究發(fā)現(xiàn),calpastatin的過表達(dá),加劇了阿霉素引起的急性心肌毒性,表... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：145 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 Calpain
        1.1.1 概述
        1.1.2 Calpain超家族的結(jié)構(gòu)
            1.1.2.1 經(jīng)典calpain的結(jié)構(gòu)
            1.1.2.2 非經(jīng)典calpain的結(jié)構(gòu)
            1.1.2.3 Calpastatin的結(jié)構(gòu)
        1.1.3 Calpain的功能
        1.1.4 Calpain與疾病的關(guān)系
    1.2 阿霉素
        1.2.1 概述
        1.2.2 阿霉素引起心肌毒性的機(jī)制
    1.3 Tet系統(tǒng)
        1.3.1 概述
        1.3.2 Tet-Off和Tet-On系統(tǒng)
    1.4 牙齦卟啉菌
        1.4.1 概述
        1.4.2 牙齦卟啉菌與牙周炎及系統(tǒng)性疾病的關(guān)系
    1.5 DNA疫苗
        1.5.1 概述
        1.5.2 DNA疫苗的作用機(jī)制
        1.5.3 DNA疫苗的佐劑
        1.5.4 DNA疫苗的應(yīng)用
    1.6 本研究的目的、試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)及意義
        1.6.1 研究的目的
        1.6.2 研究的技術(shù)路線
            1.6.2.1 體外研究calpain-2在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性中的作用
            1.6.2.2 體內(nèi)研究calpain-2在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性中的作用
            1.6.2.3 ragB/mGITRL DNA疫苗的構(gòu)建
            1.6.2.4 體內(nèi)研究DNA疫苗在牙齦卟啉菌感染中的作用
        1.6.3 研究的意義
第二章 Calpain-2轉(zhuǎn)基因小鼠系統(tǒng)的建立
    2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)動物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Calpain-2轉(zhuǎn)移基因小鼠系統(tǒng)的構(gòu)建
        2.2.2 PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型
        2.2.3 Western blot法檢測心肌組織中calpain-1和calpain-2的表達(dá)
        2.2.4 酶譜法測定心肌中calpain的活性
        2.2.5 心臟超聲法檢測模型小鼠的心功能
        2.2.6 統(tǒng)計(jì)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 建立Calpain-2轉(zhuǎn)基因小鼠系統(tǒng)
        2.3.2 Calpain-2轉(zhuǎn)基因小鼠基因型的鑒定
        2.3.3 Calpain-2在轉(zhuǎn)基因小鼠心肌中特異性過表達(dá)
        2.3.4 Calpain-2在心肌中過表達(dá)未影響小鼠心臟功能
    2.4 討論
第三章 Calpain-2在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用
    3.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)動物
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 原代新生小鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)
        3.2.2 原代心肌細(xì)胞感染腺病毒及感染效率
        3.2.3 細(xì)胞原位calpain活性的測定
        3.2.4 心肌細(xì)胞的半胱門冬氨酸蛋白酶Caspase-3活性測定
        3.2.5 DNA片段化酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測心肌細(xì)胞凋亡
        3.2.6 實(shí)時定量PCR檢測原代心肌細(xì)胞中AKT mRNA水平
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 阿霉素降低心肌細(xì)胞中calpain的活性
        3.3.2 Calpain-2過表達(dá)改善阿霉素引起的心肌細(xì)胞調(diào)亡
        3.3.3 藥理性和內(nèi)源性calpain抑制劑促進(jìn)阿霉素引起的心肌細(xì)胞調(diào)亡
        3.3.4 AKT參與calpain-2對阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
    3.4 討論
第四章 Calpain-2在阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心肌毒性模型中的作用及機(jī)制研究
    4.1 Calpain-2在阿霉素誘導(dǎo)的小鼠急性心肌毒性模型中的作用
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
            4.1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
            4.1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
            4.1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
            4.1.1.4 實(shí)驗(yàn)動物
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            4.1.2.1 建立阿霉素急性心臟毒性模型
            4.1.2.2 小鼠心肌組織的半胱門冬氨酸蛋白酶Caspase-3活性測定
            4.1.2.3 實(shí)時定量PCR檢測心肌組織中AKT mRNA水平
            4.1.2.4 Western blot法檢測AKT磷酸化水平
            4.1.2.5 心臟超聲法檢測模型小鼠的心功能
            4.1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4.1.3 結(jié)果
            4.1.3.1 Calpain-2過表達(dá)改善阿霉素引起的心功能降低
            4.1.3.2 Calpain-2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡
            4.1.3.3 AKT參與calpain-2對阿霉素引起心肌毒性的保護(hù)作用
    4.2 Calpain-2在阿霉素誘導(dǎo)的小鼠慢性心肌毒性模型中的作用
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
            4.2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
            4.2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
            4.2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
            4.2.1.4 實(shí)驗(yàn)動物
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            4.2.2.1 建立阿霉素慢性心臟毒性模型
            4.2.2.2 小鼠心臟組織石蠟包埋
            4.2.2.3 心肌組織切片WGA染色
            4.2.2.4 心肌組織的半胱門冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）活性測定
            4.2.2.5 心臟超聲法檢測模型小鼠的心功能
            4.2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        4.2.3 結(jié)果
            4.2.3.1 Calpain-2過表達(dá)改善阿霉素誘導(dǎo)的慢性心肌毒性小鼠的心功能
            4.2.3.2 Calpain-2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)阿霉素引起的慢性心臟毒性中心肌細(xì)胞的凋亡
            4.2.3.3 Calpain-2過表達(dá)改善阿霉素引起的心肌細(xì)胞肥大
            4.2.3.4 Calpain-2過表達(dá)提高阿霉素引起的慢性心臟毒性模型鼠的生存率
    4.3 討論
第五章 外膜蛋白ragB與GITRL真核共表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)
    5.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    5.2 方法
        5.2.1 PCR引物及其設(shè)計(jì)
        5.2.2 ragB基因的克隆
        5.2.3 重組質(zhì)粒pIRES-ragB、pIRES-ragB-mGITRL的構(gòu)建與鑒定
        5.2.4 重組質(zhì)粒pIRES-ragB-mGITRL的表達(dá)鑒定
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 牙齦卟啉菌外膜蛋白ragB基因的PCR擴(kuò)增
        5.3.2 重組質(zhì)粒pIRES-ragB及pIRES-ragB-mGITRL的構(gòu)建及鑒定
        5.3.3 重組質(zhì)粒pIRES-ragB-mGITRL在體外和體內(nèi)的表達(dá)
    5.4 討論
第六章 GITRL增強(qiáng)ragB DNA疫苗對抗牙齦卟啉菌感染的保護(hù)及其機(jī)制研究
    6.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料
        6.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        6.1.4 實(shí)驗(yàn)動物
    6.2 方法
        6.2.1 牙齦卟啉菌的培養(yǎng)
        6.2.2 質(zhì)粒免疫小鼠
        6.2.3 ELISPOT法檢測脾臟和骨髓中特異性抗體形成細(xì)胞
        6.2.4 實(shí)時定量PCR法檢測脾細(xì)胞中細(xì)胞因子的含量
        6.2.5 ELISA法檢測小鼠血清中細(xì)胞因子的含量
        6.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟中Tfh和IFN-γ+T細(xì)胞的含量
        6.2.7 小鼠潰瘍模型的誘導(dǎo)
        6.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 牙齦卟啉菌W83菌株的鑒定
        6.3.2 GITRL上調(diào)RagB特異性抗體和抗體形成細(xì)胞的數(shù)量
+T細(xì)胞的增殖">        6.3.3 攜帶mGITRL的ragB疫苗促進(jìn)Tfh和IFN-γ⁺T細(xì)胞的增殖
        6.3.4 攜帶mGITRL的ragB疫苗提高IL-21和IFN-γ的表達(dá)
        6.3.5 DNA疫苗對牙齦卟啉菌攻擊性潰瘍形成的影響
    6.4 討論
第七章 全文結(jié)論與展望
    7.1 全文結(jié)論
    7.2 主要創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表和待發(fā)表的論文
在讀期間主持及參與的科研項(xiàng)目
在讀期間參加的主要學(xué)術(shù)會議
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]慢性牙周炎狀態(tài)下牙齦卟啉單胞菌rag-1基因的表達(dá)變化[J]. 汪貫華,張冬梅,潘亞萍.  上�？谇会t(yī)學(xué). 2009(03)



本文編號：2927541