本文關鍵詞：惡性瘧原蟲裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2的表達和分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)表達惡性瘧原蟲裂殖子表膜蛋白 目的：采用麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)表達具有生物活性的惡性瘧原蟲裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2。 方法：惡性瘧原蟲實驗室培養(yǎng)標準株3D7提取的基因組DNA為模板，采用In-Fusion克隆技術快速連接目的片段和質(zhì)粒載體pEU-His。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，獲得含有目的基因的表達質(zhì)粒。通過雙酶切和DNA測序分析鑒定重組質(zhì)粒。中提重組質(zhì)粒后，用麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)進行表達，對表達產(chǎn)物進行純化和分析。 結(jié)果：PCR成功擴增6個目的基因片段，MSPDBL1（2043bp），MSPDBL2（2200bp），DBL1（933bp），DBL2（921bp），SPAM1（465bp），SAPM2（576bp），，并成功構建了6個用于麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)的重組質(zhì)粒，該6個重組質(zhì)粒在麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)中成功地表達出了6個重組惡性瘧原蟲蛋白rMSPDBL1（Mr74kDa），rMSPDBL2（Mr84kDa），rDBL1（Mr34kDa），rDBL2（Mr34kDa），rSPAM1（Mr17kDa），rSAPM2（Mr21kDa），經(jīng)western blotting鑒定，表達產(chǎn)物的可溶性為100%，并成功純化出重組蛋rSPAM1。 結(jié)論：麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)可以提高重組蛋白的可溶性。關于麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)表達的重組蛋白質(zhì)的純化問題，需要進一步的研究。 第二部分惡性瘧原蟲裂殖子表膜蛋白MSPDBL2-DBL2結(jié)構域的原核表達和抗原性分析 目的：克隆、表達惡性瘧原蟲疫苗候選分子裂殖子表膜蛋白MSPDBL2（PF10_0355）的DBL2結(jié)構域，并研究其抗原性。 方法：提取惡性瘧原蟲實驗室培養(yǎng)標準株3D7的基因組DNA為模板進行PCR擴增，采用In-Fusion克隆技術快速連接目的片段和質(zhì)粒載體，構建重組表達質(zhì)粒pET28a-DBL2，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL2l（DE3），異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達并經(jīng)親和層析獲得純化的重組蛋白rDBL2。分別以惡性瘧病人血清、正常人血清、對照混合血清作為一抗，蛋白質(zhì)印跡（western blotting）分析該重組蛋白的抗原性。 結(jié)果：PCR擴增獲得長約950bp片段，菌落PCR和測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET28a-DBL2構建成功，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導并經(jīng)親和層析純化后獲得相對分子質(zhì)量（Mr）約為34kDa的包涵體蛋白。經(jīng)變性條件純化得到rDBL2，western blotting分析結(jié)果顯示，該重組表達蛋白rDBL2被惡性瘧病人血清識別，有較好的抗原性。 結(jié)論：成功克隆和表達純化了惡性瘧原蟲裂殖子表膜蛋白MSPDBL2的DBL2結(jié)構域，重組蛋白rDBL2有良好的抗原性。 第三部分中緬邊境惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性分析 目的：探討中緬邊境惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性特點。 方法：中緬邊境惡性瘧病人血濾紙片提取惡性瘧原蟲基因組DNA，根據(jù)惡性瘧原蟲基因Pfmspdbl2（PF10_0355）為目的擴增片段設計特異性引物，進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，以惡性瘧原蟲標準株3D7作為參照，利對所獲得的基因序列進行測序分析，評估序列多態(tài)性。 結(jié)果：80份惡性瘧原蟲基因組DNA，PCR擴增并測序成功16個Pfmspdbl2基因片段。測序結(jié)果顯示，Pfmspdbl2基因16樣本中，野生型占87.5%（14/16），突變型占12.5%（2/16）。 結(jié)論：中緬邊境惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因具有多態(tài)性。中緬邊境惡性瘧原蟲Pfmspdbl2有陽性選擇趨勢，可能與人的抗蟲免疫的有關。
【關鍵詞】：惡性瘧原蟲 裂殖子表膜蛋白 麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng) 惡性瘧原蟲 裂殖子 原核表達 抗原性 惡性瘧原蟲 裂殖子表膜蛋白 多態(tài)性
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R382.31
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 引言11-14
• 第一部分 麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)表達惡性瘧原蟲裂殖子表膜蛋白 MSPDBL1和 MSPDBL2414-34
• 1. 材料與方法14-27
• 2. 結(jié)果27-31
• 3. 討論31-34
• 第二部分 惡性瘧原蟲 MSPDBL2-DBL2 結(jié)構域的原核表達和抗原性分析34-44
• 1. 材料和方法34-38
• 2. 結(jié)果38-41
• 3. 討論41-44
• 第三部分 中緬邊境惡性瘧原蟲 PFMSPDBL2 基因多態(tài)性分析44-50
• 1. 材料和方法44-46
• 2. 結(jié)果46-48
• 3. 討論48-50
• 小結(jié)50-52
• 參考文獻52-58
• 綜述58-67
• 1. 瘧原蟲入侵紅細胞和紅細胞黏附的相關過程59
• 2. 惡性瘧原蟲中的 DBL（Duffy binding-like）結(jié)構域超家族59-62
• 3. 展望62-63
• 參考文獻63-67
• 英文縮略詞表67-68
• 碩士在讀期間研究成果68-69
• 致謝69-70

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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2 黃智勇;;贊比亞軍隊總院住院患者病種分析[J];華南國防醫(yī)學雜志;2014年04期

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本文編號：292018