目的利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立巴馬小型豬胚胎成纖維細(xì)胞（porcine fetal fibroblasts, PFFs）α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1, 3-galactosyltransferase,GGTA1）/β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶（β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase,β4GalNT2）雙基因敲除細(xì)胞系,為構(gòu)建α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose,α-Gal）和SD（a）抗原缺失的巴馬小型豬模型奠定基礎(chǔ)。方法分別選取豬GGTA1基因的第三外顯子和β4GalNT2基因的第八外顯子為敲除靶點(diǎn),利用在線工具（http://crispr.mit.edu）設(shè)計(jì)并合成單導(dǎo)向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以含有Cas9基因的pX330質(zhì)粒為骨架構(gòu)建打靶載體,轉(zhuǎn)染野生巴馬小型豬的PFFs,用T7EN1酶切驗(yàn)證打靶載體敲除效率。將打靶載體與G418抗性質(zhì)粒（tdTomato）共轉(zhuǎn)染巴馬小型豬PFFs,經(jīng)藥物篩選獲得陽性單細(xì)胞克隆后測序鑒定基因型。結(jié)果成功構(gòu)建靶向GGTA1和β4Ga... 

【文章來源】：實(shí)用器官移植電子雜志. 2019年04期 第277-282頁

【文章頁數(shù)】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)材料：
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒：
        1.2.3 克隆細(xì)胞篩選與鑒定：
        1.2.4 T7EN1酶切檢測突變效率：
        1.2.5 體細(xì)胞克�。�
        1.2.6 獲得雙基因雙敲的巴馬小型豬：
        1.2.7
2 結(jié)果
    2.1 GGTA1/β4GalNT2基因CRISPR/Cas9靶向載體的構(gòu)建：
    2.2 T7EN1酶酶切實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證sgRNAs敲除效率：
    2.3單細(xì)胞克隆的獲得和鑒定：
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的β4GalNT2基因敲除豬制備[J]. 唐雨婷,高景波,龍川,杜敏杰,黃林華,潘登科,杜曉華.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2017(10)
[2]基因修飾豬作為異種器官移植供體的研究進(jìn)展[J]. 李文玲,鮑磊,肖磊.  中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào). 2014(09)
[3]巴馬小型豬在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 龐琳琳,張會永,楊關(guān)林.  中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào). 2014(01)
[4]利用體細(xì)胞LOH突變制備α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GGTA1）缺失的五指山小型豬[J]. 王飛,馮沖,龍川,岳成鶴,王寧,李西睿,曹隨忠,李明洲,儲明星,潘登科,帥素容.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(04)
[5]利用啟動(dòng)子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1基因[J]. 鄭道山,馮沖,朱彥賓,龍川,馮書堂,潘登科,馬文麗.  生物技術(shù)通訊. 2011(04)

博士論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建C3基因敲除豬模型和穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的人胚胎干細(xì)胞系的建立[D]. 張緯.南京醫(yī)科大學(xué) 2017

碩士論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建ApoE-/-豬模型[D]. 袁益琳.南京醫(yī)科大學(xué) 2016



本文編號：2912610