本文關(guān)鍵詞：CpG-ODN c41免疫特性及無刺激性內(nèi)化機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在固有免疫中，TLR9能特異性識(shí)別微生物非甲基化CpG-DNA（CpG-ODN），激發(fā)MyD88信號(hào)級(jí)聯(lián)，釋放促炎因子TNF-α，IL-6等，對(duì)消除病原體入侵具有十分重要的意義。然而，當(dāng)TLR過度活化，大量促炎因子釋放，又會(huì)引起針對(duì)宿主自身的炎性病理損傷。在前期研究中，本課題組新發(fā)現(xiàn)的一種特殊的CpG-ODN分子，命名為CpG-ODN c41（CpG-c41），它內(nèi)化入胞后并不引起細(xì)胞因子釋放，無免疫刺激性。由此我們將CpG-c41的內(nèi)化稱為“無刺激性內(nèi)化”。此外，CpG-c41能抑制刺激性CpG-ODN誘導(dǎo)的促炎因子釋放，具有顯著的抑炎作用，但其分子作用機(jī)制和免疫特性尚不完全清楚。本課題從多角度對(duì)CpG-c41的免疫特性，及其對(duì)TLR9信號(hào)通路抑制機(jī)制進(jìn)行深入研究。 此外，在TLR9信號(hào)抑制途徑研究中，除了作為TLR9配體的CpG-c41之外，miRNA作為一種負(fù)調(diào)控機(jī)制也引起了廣泛關(guān)注。為了突破實(shí)驗(yàn)方法的局限性，尋找更多的與TLR9乃至整個(gè)Toll-樣受體家族信號(hào)通路相關(guān)miRNA，本研究建立了一種目前最為完整的直接從前體miRNA預(yù)測(cè)成熟miRNA的miRNA預(yù)測(cè)模型，F(xiàn)OMmiR，并嘗試用FOMmiR從非編碼RNA中預(yù)測(cè)成熟miRNA后，在整個(gè)Toll-樣受體信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA3’UTR中進(jìn)行局部序列比對(duì)（Blast），探索miRNA的靶基因。 CpG-c41產(chǎn)生的TLR9信號(hào)通路抑制機(jī)制研究，以及探尋Toll-樣受體相關(guān)信號(hào)通路miRNA有助于為臨床抗炎抗過敏治療提供新的策略。 目的： 明確CpG-c41的免疫特性及其無刺激性內(nèi)化的機(jī)制，包括CpG-c41與刺激性CpG-ODN之間的競(jìng)爭(zhēng)入胞如何發(fā)生，以及這種競(jìng)爭(zhēng)在信號(hào)通路中所處位置。并建立準(zhǔn)確的miRNA預(yù)測(cè)模型，探尋TLR9信號(hào)通路相關(guān)miRNA。 方法： 1.通過ELISA實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量CpG-c41對(duì)CpG-1826誘導(dǎo)的TLR9活化的影響，CpG-c41對(duì)CpG-1826誘導(dǎo)的TLR9活化不同的影響，CpG-c41對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的影響； 2.采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦定位來觀察CpG-c41在胞內(nèi)的內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)過程； 3.采用蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在CpG-c41作用下TLR9-MyD88下游信號(hào)通路的活化情況； 4.運(yùn)用生物信息學(xué)方法建立miRNA預(yù)測(cè)模型，并探尋TLR9信號(hào)通路相關(guān)miRNA。 結(jié)果： 1. CpG-c41作用細(xì)胞后，不引起細(xì)胞因子釋放，表現(xiàn)出無免疫刺激性。 2. CpG-c41與CpG-1826同時(shí)作用于細(xì)胞情況下， CpG-c41能夠有效抑制CpG-1826誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子釋放，產(chǎn)生了抑炎作用，且存在顯著的量效關(guān)系。 3.在CpG-1826誘導(dǎo)的TLR9活化的不同時(shí)相點(diǎn)加入CpG-c41，對(duì)TLR9早期TNF-α釋放和晚期IL-6均有顯著的抑制作用，且越早加入CpG-c41，抑制效果越明顯。 4. CpG-1826作用細(xì)胞24h后，顯微鏡觀察到明顯的凋亡泡，而CpG-c41作用后的細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)正常。接受再次CpG-1826刺激時(shí)，CpG-1826預(yù)處理組喪失免疫應(yīng)答能力，細(xì)胞因子釋放水平顯著降低；CpG-c41預(yù)處理組免疫應(yīng)答能力受影響較小，細(xì)胞因子釋放保持較高水平。 5.免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CpG-c41在早期內(nèi)體中被TLR9識(shí)別。 6.蛋白印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CpG-c41并未激活TLR9-MyD88信號(hào)通路的下游通路；較單獨(dú)CpG-1826刺激，用CpG-c41和CpG-1826的混合物作用于細(xì)胞后MyD88信號(hào)級(jí)聯(lián)的下游子通路均受到顯著的抑制。 7.建立了一種新的基于二級(jí)結(jié)構(gòu)模式的定階馬爾科夫模型的miRNA預(yù)測(cè)算法，F(xiàn)OMmiR實(shí)現(xiàn)了從發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列預(yù)測(cè)成熟miRNA的全功能識(shí)別。 8.通過將由FOMmiR從非編碼RNA中預(yù)測(cè)的成熟miRNA的反向互補(bǔ)鏈與Toll-樣受體信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA3’UTR序列進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)785條序列的907條miRNA與82個(gè)基因之間存在1340個(gè)交互作用，其中2條miRNA（miR-15a和miR-146a）在文獻(xiàn)中有報(bào)道。 結(jié)論： 1. CpG-c41的免疫學(xué)特性 CpG-c41對(duì)刺激性CpG-ODN的抑炎效應(yīng)具有顯著的量效關(guān)系與時(shí)效關(guān)系。CpG-c41與CpG-1826濃度比為1:1時(shí)，TNF-α釋放水平降低約50%，當(dāng)濃度比為4:1時(shí)，TNF-α釋放水平降低超過90%。在刺激性CpG-ODN作用細(xì)胞3h內(nèi)加入CpG-c41，對(duì)早期TNF-α釋放均有顯著的抑制效果，30min中內(nèi)加入效果最好；后期在20h內(nèi)加入CpG-c41對(duì)晚期IL-6的釋放均有顯著的抑制效果，在16h之前加入效果更明顯。 2. CpG-c41的抑炎作用機(jī)制 免疫熒光結(jié)果顯示CpG-c41通過比CpG-1826更高效的內(nèi)化過程入胞，并在早期內(nèi)體中被TLR9識(shí)別。正是CpG-c41對(duì)受體的高親和力使其與刺激性CpG-ODN爭(zhēng)奪受體，阻礙了刺激性CpG-ODN內(nèi)化入胞與TLR9結(jié)合。 盡管CpG-c41與TLR9發(fā)生結(jié)合，然而蛋白印記結(jié)果顯示CpG-c41并未激活TLR9-MyD88信號(hào)通路的下游NF-κB和MAPKs通路，因此CpG-c41并不引起細(xì)胞因子的釋放，無免疫刺激性。加入CpG-c41后，CpG-1826誘導(dǎo)的TLR9-MyD88信號(hào)通路的下游通路活性顯著降低，從而產(chǎn)生抑炎效應(yīng)。 3. TLR9通路相關(guān)miRNA 為了突破實(shí)驗(yàn)方法的局限性，尋找更多的與TLR9乃至整個(gè)Toll-樣受體家族信號(hào)通路相關(guān)miRNA，我們建立了一種最為完整的直接從前體miRNA預(yù)測(cè)成熟miRNA的miRNA預(yù)測(cè)模型，F(xiàn)OMmiR。并嘗試用FOMmiR從非編碼RNA中預(yù)測(cè)成熟miRNA，并在整個(gè)Toll-樣受體信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA3’UTR中進(jìn)行局部序列比對(duì)（Blast），探索miRNA的靶基因，結(jié)果中有2條miRNA已有文獻(xiàn)報(bào)道。
【關(guān)鍵詞】：TLR9 CpG-c41 無刺激性內(nèi)化 FOMmiR miRNA
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 1.1 選題緣由13
• 1.2 研究背景13-14
• 1.3 研究意義14-15
• 1.4 研究?jī)?nèi)容15
• 1.5 研究方法15-17
• 第二章 CpG-c41 的免疫特性17-27
• 2.1 材料和方法17-20
• 2.2 結(jié)果20-25
• 2.3 小結(jié)25-27
• 第三章 CpG-c41 無刺激性內(nèi)化機(jī)制27-41
• 3.1 材料和方法27-34
• 3.2 結(jié)果34-39
• 3.3 小結(jié)39-41
• 第四章 探尋 TLR9 信號(hào)通路相關(guān) miRNA41-50
• 4.1 材料和方法42-44
• 4.2 結(jié)果44-48
• 4.3 小結(jié)48-50
• 全文總結(jié)50-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 文獻(xiàn)綜述58-70
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果70-71
• 致謝71

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2 李s，

本文編號(hào)：290524