瘧疾是嚴重危害人類健康的蟲媒傳染病，廣泛流行于熱帶和亞熱帶一些發(fā)展中國家。瘧疾的診斷是瘧疾防治工作中的一個重要環(huán)節(jié)，當(dāng)前瘧疾的發(fā)病率和死亡率難以控制的一個重要原因就是在瘧疾流行區(qū)缺乏有效的診斷和治療手段。傳統(tǒng)依靠厚血膜鏡檢診斷方法已越來越不能適應(yīng)當(dāng)前瘧疾診斷的需要。QBC法及Kawamoto法雖然敏感性比血涂片鏡檢法提高了8倍以上，特異性達98.4％，但其所使用的毛細管價格昂貴（每支0.8美元），又不能重復(fù)使用，操作上也較繁瑣，且難以有效地進行蟲株鑒別及蟲體計數(shù)，因此難以在基層推廣應(yīng)用。八十年代以來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而出現(xiàn)的基因診斷技術(shù)（分子雜交，PCR、套式PCR、熒光定量PCR等），顯示了較高的敏感性和特異性，且能對瘧原蟲的感染作出早期快速的診斷，但也存在著需要特殊儀器設(shè)備和反應(yīng)試劑較昂貴的問題。以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的血清學(xué)檢測，特別是近幾年來發(fā)展的以單抗為基礎(chǔ)的Dipstick技術(shù)，由于操作簡便、快速，結(jié)果易于判定，在瘧疾診斷上日漸受到重視并展示了廣闊的應(yīng)用前景。目前美國、澳大利亞等已開發(fā)出ParaSight-F（Becton Dickinson，Cockeysoville，Mary... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：116 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
縮略詞
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
    材料和方法
        一、 材料
        二、 實驗方法
            （一） 引物設(shè)計
            （二） 惡性瘧原蟲基因組DNA的提取
            （三） PCR擴增
            （四） LDHpf基因的克隆
                1. 質(zhì)粒DNA的制備及酶切
                2. 目的基因片段LDH的純化、酶切
                3. 目的片斷的分離和回收
                4. 目的基因片斷與載體的連接反應(yīng)
                5. 感受態(tài)細胞的制備
                6. 轉(zhuǎn)化
            （五） 重組克隆的篩選及鑒定
                1. 初步鑒定
                2. PCR鑒定
                3. 酶切鑒定
            （六） LDHpf基因序列測定及同源性分析
    結(jié)果
        一、 LDH基因的擴增
        二、 重組克隆的篩選及鑒定
        三、 序列的測定及同源性分析
    討論
    小結(jié)
第二部分 重組蛋白的表達、純化及免疫原性研究
    一、 材料
    二、 實驗方法
        （一） LDH基因的誘導(dǎo)表達
        （二） 表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析
        （三） 表達產(chǎn)物酶活性測定
        （四） 表達產(chǎn)物的純化
        （五） 表達產(chǎn)物抗原性分析
            1. ELISA
            2. Western-blot
            3. 免疫血清的制備
            4. 免疫血清的鑒定
    結(jié)果
        一、 重組質(zhì)粒的表達
            （一） 表達條件的優(yōu)化
                1. 誘導(dǎo)時機
                2. 誘導(dǎo)時間
                3. 誘導(dǎo)劑濃度
            （二） 表達產(chǎn)物酶活性測定
        二、 表達蛋白的純化
        三、 表達產(chǎn)物免疫學(xué)鑒定
        四、 多抗制備及鑒定
    討論
    小結(jié)
第三部分 單克隆抗體的制備及鑒定
    一、 材料
    二、 實驗方法
        （一） 抗原制備
        （二） 動物免疫
        （三） 細胞融合
        （四） 陽性克隆的篩選與克隆化
        （五） 單克隆抗體的Ig類與亞類鑒定
        （六） 雜交瘤細胞的染色體分析
        （七） 誘生腹水
        （八） 效價測定
        （九） 單克隆抗體的SDS-PAGE分析
        （十） 單克隆抗體特異性鑒定
            1. ELISA
            2. Dot-ELISA
            3. Western-blot
    結(jié)果
        一、 雜交瘤細胞株的建立
        二、 單克隆抗體的類及亞類
        三、 單克隆抗體的效價
        四、 染色體鑒定
        五、 單克隆抗體的SDS-PAGE分析
        六、 單克隆抗體特異性鑒定
    討論
    小結(jié)
第四部分 瘧疾的診斷研究
    一、 材料
    二、 實驗方法
        （一） 鏡檢
        （二） PCR檢測
            1. 模板DNA制備
            2. PCR反應(yīng)
            3. PCR產(chǎn)物的序列測定
        （三） ICT2檢測
            1. ICT2測試卡操作
            2. 結(jié)果判定
        （四） 免疫膠體金層析檢測
            1. 單抗的純化
            2. 直徑20～30nm膠體金的制備
            3. 最適蛋白質(zhì)濃度測定
            4. 膠體金的標(biāo)記
            5. 免疫膠體金層析試紙條的制作
            6. 反應(yīng)模式的建立
            7. 最低檢測量的測定
            8. 瘧疾血樣的檢測
            9. 穩(wěn)定性檢測
        （五） 酶活性檢測
            1. 電泳法
            2. 酶比色法
                2.1. 不同原蟲感染率LDHpf活性的檢測
                2.2. 培養(yǎng)時間對LDHpf活性的影響
                2.3. LDHpf活性用于監(jiān)測藥物療效的初步研究
        （六） 免疫捕獲LDH活性檢測法
        （七） 數(shù)據(jù)處理
    結(jié)果
        一、 鏡檢
        二、 PCR檢測
        三、 ICT2檢測
        四、 免疫膠體金層析法（GICA）檢測
            （一） 單抗的純化
            （二） 1ml膠體金的最適標(biāo)記量的試驗
            （三） 免疫膠體金層析法模式的建立
            （四） 最低檢測量的測定
            （五） 瘧疾血樣檢測
            （六） 穩(wěn)定性測試
        五、 LDH活性檢測法
            （一） 電泳法
            （二） 酶比色法
                1. 不同原蟲感染率LDHpf活性的檢測
                2. 培養(yǎng)時間對LDHpf活性的影響
                3. LDHpf活性用于監(jiān)測藥物療效的初步研究
        六、 免疫捕獲LDH活性檢測法
    討論
        一、 PCR法
        二、 免疫膠體金層析檢測
            （一） ICT2檢測
            （二） 以LDHpf單抗為基礎(chǔ)的免疫膠體金層析法檢測
        三、 酶活性檢測
        四、 免疫捕獲LDH活性檢測法
    小結(jié)
總結(jié)
參考文獻
致謝
綜述一
綜述二
附錄1： 博士期間論文發(fā)表情況
附錄2： Genbank登錄情況


【參考文獻】：
期刊論文
[1]膠體金免疫結(jié)合試驗在檢驗醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 王培之,徐克沂,皮國華.  中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志. 2000(05)
[2]瘧原蟲乳酸脫氫酶活性檢測法和有限稀釋法在篩選和建立惡性瘧原蟲克隆株時的應(yīng)用[J]. 董瑩,李菊曰升,高白荷.  實用寄生蟲病雜志. 2000(02)
[3]惡性瘧原蟲熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法的建立[J]. 江曉玲,李明,徐偉文,畢惠祥,程鋼,李虎,諸欣平.  中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志. 2000(02)
[4]快速免疫色譜測試卡診斷惡性瘧和間日瘧的效果評價[J]. 鄭香,湯林華,許永湘,蒙鋒,祝衛(wèi)東,顧政誠,錢會霖.  中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 1999(04)
[5]惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶的快速電泳法檢測及影響因素[J]. 劉玉冰,王福勇,劉瑞娟,余志偉,王輝東,程義亮.  中國人獸共患病雜志. 1999(02)
[6]惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶活性的初步檢測[J]. 符式剛,邢奇芬,龐啟濱.  海南醫(yī)學(xué). 1999(01)
[7]通過電子郵件開展核酸和蛋白質(zhì)序列分析[J]. 胡德華,方平.  生命的化學(xué). 1999(01)
[8]聚合酶鏈反應(yīng)檢測間日瘧原蟲的現(xiàn)場應(yīng)用研究[J]. 李雪宏,黃海燕,張淑貞.  中國寄生蟲病防治雜志. 1998(03)
[9]套式PCR擴增特定SSrRNA基因片段診斷間日瘧及混合感染的研究[J]. 諸欣平,李明,董潔,周蕾,王學(xué)忠,王鳳云.  中國寄生蟲病防治雜志. 1998(02)
[10]快速免疫色譜測試法診斷惡性瘧的初步觀察[J]. 祝衛(wèi)東,湯林華,鄭香,羅曼珍,顧政誠,錢會霖,瞿靖琦.  中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 1998(02)



本文編號：2901767