細(xì)胞遷移是許多細(xì)胞的基本特性,在許多生理和病理過程中起著重要的作用,比如血管新生和免疫應(yīng)答等。遷移運動受內(nèi)部和外部信號控制,這些信號激活復(fù)雜的信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致actin-myosin和微管細(xì)胞骨架高度動態(tài)和集中的重塑,以及細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用。一些微管相關(guān)蛋白通過與微管相互作用而參與到細(xì)胞極化和遷移過程中。 HOP是共伴侶蛋白家族的一員,它能通過TPR結(jié)構(gòu)域直接與Hsp70和Hsp90相結(jié)合,促進(jìn)多伴侶分子復(fù)合物的形成,調(diào)節(jié)它們的活性。除此之外,HOP還可以與其他分子伴侶相互作用,甚至還涉及一些與Hsp70/Hsp90分子伴侶體系無關(guān)的細(xì)胞活動過程。HOP在細(xì)胞運動及上皮細(xì)胞功能中的參與的角色還有很多未知。在第一部分研究中,我們證實HOP在血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管新生中起到十分重要的作用。體外血管形成實驗和細(xì)胞出芽實驗揭示清除HOP表達(dá)會顯著抑制血管從血管內(nèi)皮細(xì)胞形成。劃痕實驗和transwell遷移實驗顯示HOP對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移很重要。通過檢查中心粒再定位和細(xì)胞膜皺褶動態(tài)性,我們發(fā)現(xiàn)HOP在應(yīng)答遷移刺激的細(xì)胞極化的過程中起到重要的作用。更進(jìn)一步的,我們的結(jié)果顯示在血管內(nèi)皮細(xì)胞中HOP與微管蛋白相互作用并與微管共定位。這些發(fā)現(xiàn)表明HOP是一個血管新生的新的調(diào)節(jié)因子,它能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞極化和遷移。 中性粒細(xì)胞是天然免疫中最多和最重要的細(xì)胞組分。在受到巨噬細(xì)胞的招募后,大量的滲出血管,進(jìn)入到感染的組織部位識別、吞噬并清除病原體。其中,在粘附、遷移和吞噬等過程中中性粒細(xì)胞的actin細(xì)胞骨架發(fā)生高度變化。因此,actin動態(tài)性的調(diào)節(jié)對中性粒細(xì)胞在天然免疫過程中執(zhí)行其功能起到關(guān)鍵作用。 研究證實已有許多因子參與到actin多聚化的正向誘導(dǎo),但對潛在的負(fù)向調(diào)節(jié)因子的研究還很少。在第二部分研究中,我們發(fā)現(xiàn)在被刺激的中性粒細(xì)胞中,生理上基于NADPH氧化酶作用產(chǎn)生的活性氧(ROS)通過驅(qū)動可逆性actin谷胱甘肽化來負(fù)向調(diào)節(jié)actin多聚化。清除ROS會導(dǎo)致聚合型actin(F-actin)總量增加。Grx1是哺乳動物細(xì)胞中主要的催化actin去谷胱甘肽化的酶。干擾Grx1的表達(dá)會增加actin谷胱甘肽化,抑制actin多聚化；繼而損害中性粒細(xì)胞的極化、趨化、粘附和吞噬作用。與之一致的,Grx1基因敲除小鼠的中性粒細(xì)胞募集到體內(nèi)炎癥位點的行動力受損,并且噬菌能力降低。相對的,過表達(dá)Grx1則會降低actin谷光甘肽化水平,增加F-actin含量。綜上所述,這些結(jié)果表明在中性粒細(xì)胞的actin動態(tài)性調(diào)節(jié)過程中,Grx和ROS誘導(dǎo)的可逆性actin谷胱甘肽化占據(jù)重要的生理性地位。
【學(xué)位單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R329.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    第一節(jié) 細(xì)胞遷移中的細(xì)胞骨架
        1.1.1 細(xì)胞遷移
        1.1.2 細(xì)胞遷移中的微絲
        1.1.3 微管在細(xì)胞遷移的作用
    第二節(jié) 中性粒細(xì)胞
        1.2.1 中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和釋放
        1.2.2 中性粒細(xì)胞募集到炎癥部位的過程及調(diào)控
        1.2.3 中性粒細(xì)胞殺菌機(jī)制
    第三節(jié) Hsp70/Hsp90 Organizing Protein（HOP）簡述
        1.3.1 HOP的發(fā)現(xiàn)和遺傳學(xué)信息
        1.3.2 HOP調(diào)節(jié)Hsp90和Hsp70活性
        1.3.3 HOP的TPR及其他功能性結(jié)構(gòu)域
        1.3.4 HOP的其他生物學(xué)功能
    第四節(jié) S-谷光甘肽化簡述
        1.4.1 S-谷光甘肽化
        1.4.2 Grx（glutaredoxin）
        1.4.3 S-谷光甘肽化調(diào)節(jié)的細(xì)胞活動
第二章 HOP調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移
    第一節(jié) 材料、試劑與方法
        2.1.1 本章所用細(xì)胞系
        2.1.2 本章所用的抗體
        2.1.3 本章所用主要藥品試劑
        2.1.4 本章用儀器設(shè)備
        2.1.5 本章所用質(zhì)粒及構(gòu)建
        2.1.6 shRNA的構(gòu)建
        2.1.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        2.1.8 siRNA的轉(zhuǎn)染
        2.1.9 免疫雜交（Western blotting）
        2.1.10 融合蛋白GST-HOP的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.1.11 免疫共沉淀
        2.1.12 GST-pulldown
        2.1.13 免疫熒光染色實驗
        2.1.14 SRB檢測細(xì)胞增殖
        2.1.15 AnnexinⅤ檢測細(xì)胞凋亡
        2.1.16 細(xì)胞劃痕愈合實驗
        2.1.17 Transwell細(xì)胞遷移實驗
        2.1.18 血管內(nèi)皮細(xì)胞體外成管實驗
        2.1.19 三維毛細(xì)血管出芽形成實驗
        2.1.20 細(xì)胞極化實驗
        2.1.21 活細(xì)胞膜皺褶實驗
    第二節(jié) 本章實驗結(jié)果
        2.2.1 HOP促進(jìn)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞成管和毛細(xì)血管出芽
        2.2.2 敲減HOP不影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖或凋亡速率
        2.2.3 HOP對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移很重要
        2.2.4 HOP調(diào)節(jié)遷移細(xì)胞極性和膜皺褶動態(tài)性
        2.2.5 HOP與微管共定位,并與微管蛋白相互作用
        2.2.6 胞外HOP不影響血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移或體外成管
第三章 谷胱甘肽化調(diào)控中性粒細(xì)胞的actin動態(tài)性
    第一節(jié) 材料與方法
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 培養(yǎng)和分化HL60細(xì)胞
        3.1.3 中性粒細(xì)胞分離
        3.1.4 細(xì)胞裂解和谷光甘肽化的免疫雜交
        3.1.5 EZ-taxiscan趨化實驗
        3.1.6 分析細(xì)胞運動軌跡和形態(tài)
        3.1.7 HL60細(xì)胞系中野生型和突變型actin的表達(dá)
        3.1.8 細(xì)胞皺褶（極化）實驗
        3.1.9 體外吞噬作用實驗
        3.1.10 腹膜炎模型體內(nèi)噬菌作用
        3.1.11 ¨中性粒細(xì)胞繼承性移植
        3.1.12 Luminol化學(xué)發(fā)光法來測量ROS
        3.1.13 Wright-Giemsa染色
    第二節(jié) 本章實驗結(jié)果
        3.2.1 ROS提升被刺激的中性粒細(xì)胞actin谷光甘肽化水平
        3.2.2 ROS和谷光甘肽化蛋白在趨化中的中性粒細(xì)胞的定位
        3.2.3 ROS的清除導(dǎo)致F-actin總量明顯增高
        3.2.4 過表達(dá)Grx1對actin動態(tài)性和趨化的影響
        3.2.5 干擾Grx1修復(fù)清除ROS引起的中性粒細(xì)胞趨化缺陷
        3.2.6 Grx1是actin動態(tài)性的關(guān)鍵生理調(diào)節(jié)因子
        3.2.7 Grx1的敲除削弱腹膜炎鼠的中性粒細(xì)胞募集和殺菌能力
第四章 結(jié)論與展望
    第一節(jié) HOP在細(xì)胞遷移中的作用
    第二節(jié) 谷光甘肽化修飾對actin動態(tài)性的調(diào)控
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果
    個人簡歷
    在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2890440