細胞遷移是許多細胞的基本特性,在許多生理和病理過程中起著重要的作用,比如血管新生和免疫應答等。遷移運動受內部和外部信號控制,這些信號激活復雜的信號傳導級聯(lián)反應,導致actin-myosin和微管細胞骨架高度動態(tài)和集中的重塑,以及細胞與細胞、細胞與基質之間的相互作用。一些微管相關蛋白通過與微管相互作用而參與到細胞極化和遷移過程中。 HOP是共伴侶蛋白家族的一員,它能通過TPR結構域直接與Hsp70和Hsp90相結合,促進多伴侶分子復合物的形成,調節(jié)它們的活性。除此之外,HOP還可以與其他分子伴侶相互作用,甚至還涉及一些與Hsp70/Hsp90分子伴侶體系無關的細胞活動過程。HOP在細胞運動及上皮細胞功能中的參與的角色還有很多未知。在第一部分研究中,我們證實HOP在血管內皮細胞遷移和血管新生中起到十分重要的作用。體外血管形成實驗和細胞出芽實驗揭示清除HOP表達會顯著抑制血管從血管內皮細胞形成。劃痕實驗和transwell遷移實驗顯示HOP對血管內皮細胞遷移很重要。通過檢查中心粒再定位和細胞膜皺褶動態(tài)性,我們發(fā)現(xiàn)HOP在應答遷移刺激的細胞極化的過程中起到重要的作用。更進一步的,我們的結果顯示在血管內皮細胞中HOP與微管蛋白相互作用并與微管共定位。這些發(fā)現(xiàn)表明HOP是一個血管新生的新的調節(jié)因子,它能促進血管內皮細胞極化和遷移。 中性粒細胞是天然免疫中最多和最重要的細胞組分。在受到巨噬細胞的招募后,大量的滲出血管,進入到感染的組織部位識別、吞噬并清除病原體。其中,在粘附、遷移和吞噬等過程中中性粒細胞的actin細胞骨架發(fā)生高度變化。因此,actin動態(tài)性的調節(jié)對中性粒細胞在天然免疫過程中執(zhí)行其功能起到關鍵作用。 研究證實已有許多因子參與到actin多聚化的正向誘導,但對潛在的負向調節(jié)因子的研究還很少。在第二部分研究中,我們發(fā)現(xiàn)在被刺激的中性粒細胞中,生理上基于NADPH氧化酶作用產生的活性氧(ROS)通過驅動可逆性actin谷胱甘肽化來負向調節(jié)actin多聚化。清除ROS會導致聚合型actin(F-actin)總量增加。Grx1是哺乳動物細胞中主要的催化actin去谷胱甘肽化的酶。干擾Grx1的表達會增加actin谷胱甘肽化,抑制actin多聚化；繼而損害中性粒細胞的極化、趨化、粘附和吞噬作用。與之一致的,Grx1基因敲除小鼠的中性粒細胞募集到體內炎癥位點的行動力受損,并且噬菌能力降低。相對的,過表達Grx1則會降低actin谷光甘肽化水平,增加F-actin含量。綜上所述,這些結果表明在中性粒細胞的actin動態(tài)性調節(jié)過程中,Grx和ROS誘導的可逆性actin谷胱甘肽化占據重要的生理性地位。
【學位單位】：南開大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R329.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    第一節(jié) 細胞遷移中的細胞骨架
        1.1.1 細胞遷移
        1.1.2 細胞遷移中的微絲
        1.1.3 微管在細胞遷移的作用
    第二節(jié) 中性粒細胞
        1.2.1 中性粒細胞的產生和釋放
        1.2.2 中性粒細胞募集到炎癥部位的過程及調控
        1.2.3 中性粒細胞殺菌機制
    第三節(jié) Hsp70/Hsp90 Organizing Protein（HOP）簡述
        1.3.1 HOP的發(fā)現(xiàn)和遺傳學信息
        1.3.2 HOP調節(jié)Hsp90和Hsp70活性
        1.3.3 HOP的TPR及其他功能性結構域
        1.3.4 HOP的其他生物學功能
    第四節(jié) S-谷光甘肽化簡述
        1.4.1 S-谷光甘肽化
        1.4.2 Grx（glutaredoxin）
        1.4.3 S-谷光甘肽化調節(jié)的細胞活動
第二章 HOP調節(jié)血管內皮細胞遷移
    第一節(jié) 材料、試劑與方法
        2.1.1 本章所用細胞系
        2.1.2 本章所用的抗體
        2.1.3 本章所用主要藥品試劑
        2.1.4 本章用儀器設備
        2.1.5 本章所用質粒及構建
        2.1.6 shRNA的構建
        2.1.7 質粒轉染
        2.1.8 siRNA的轉染
        2.1.9 免疫雜交（Western blotting）
        2.1.10 融合蛋白GST-HOP的誘導表達
        2.1.11 免疫共沉淀
        2.1.12 GST-pulldown
        2.1.13 免疫熒光染色實驗
        2.1.14 SRB檢測細胞增殖
        2.1.15 AnnexinⅤ檢測細胞凋亡
        2.1.16 細胞劃痕愈合實驗
        2.1.17 Transwell細胞遷移實驗
        2.1.18 血管內皮細胞體外成管實驗
        2.1.19 三維毛細血管出芽形成實驗
        2.1.20 細胞極化實驗
        2.1.21 活細胞膜皺褶實驗
    第二節(jié) 本章實驗結果
        2.2.1 HOP促進體外血管內皮細胞成管和毛細血管出芽
        2.2.2 敲減HOP不影響血管內皮細胞增殖或凋亡速率
        2.2.3 HOP對血管內皮細胞遷移很重要
        2.2.4 HOP調節(jié)遷移細胞極性和膜皺褶動態(tài)性
        2.2.5 HOP與微管共定位,并與微管蛋白相互作用
        2.2.6 胞外HOP不影響血管內皮細胞遷移或體外成管
第三章 谷胱甘肽化調控中性粒細胞的actin動態(tài)性
    第一節(jié) 材料與方法
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 培養(yǎng)和分化HL60細胞
        3.1.3 中性粒細胞分離
        3.1.4 細胞裂解和谷光甘肽化的免疫雜交
        3.1.5 EZ-taxiscan趨化實驗
        3.1.6 分析細胞運動軌跡和形態(tài)
        3.1.7 HL60細胞系中野生型和突變型actin的表達
        3.1.8 細胞皺褶（極化）實驗
        3.1.9 體外吞噬作用實驗
        3.1.10 腹膜炎模型體內噬菌作用
        3.1.11 ¨中性粒細胞繼承性移植
        3.1.12 Luminol化學發(fā)光法來測量ROS
        3.1.13 Wright-Giemsa染色
    第二節(jié) 本章實驗結果
        3.2.1 ROS提升被刺激的中性粒細胞actin谷光甘肽化水平
        3.2.2 ROS和谷光甘肽化蛋白在趨化中的中性粒細胞的定位
        3.2.3 ROS的清除導致F-actin總量明顯增高
        3.2.4 過表達Grx1對actin動態(tài)性和趨化的影響
        3.2.5 干擾Grx1修復清除ROS引起的中性粒細胞趨化缺陷
        3.2.6 Grx1是actin動態(tài)性的關鍵生理調節(jié)因子
        3.2.7 Grx1的敲除削弱腹膜炎鼠的中性粒細胞募集和殺菌能力
第四章 結論與展望
    第一節(jié) HOP在細胞遷移中的作用
    第二節(jié) 谷光甘肽化修飾對actin動態(tài)性的調控
參考文獻
致謝
個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果
    個人簡歷
    在學期間發(fā)表的學術論文

【共引文獻】

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本文編號：2890440