Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)具有較強(qiáng)的抗病毒活性,并在機(jī)體對抗病毒感染中發(fā)揮舉足輕重的作用。病毒感染機(jī)體后,其保守的病原相關(guān)分子模式可被Toll樣受體(Toll like receptors)、維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ受體RIG-Ⅰ-like receptors, RLRs)等模式識別受體(Pattern-recognition receptors, PRRs)所識別,通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo),最終激活免疫細(xì)胞釋放Ⅰ型干擾素及促炎癥細(xì)胞因子,從而發(fā)揮抗病毒作用。 蛋白的泛素化作用在RIG-Ⅰ受體的活化和抗病毒免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。然而,與RIG-Ⅰ活化相關(guān)的去泛素化作用的功能尚不明確。我們研究發(fā)現(xiàn),泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin-specific protease4, USP4)可以通過其去泛素化酶活性來調(diào)節(jié)RIG-Ⅰ的表達(dá)和活化。病毒感染誘導(dǎo)RIG-Ⅰ激活后,USP4的表達(dá)明顯降低。而USP4的過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)RIG-Ⅰ的表達(dá)并上調(diào)其活化誘導(dǎo)的IFN-β的釋放,同時(shí)抑制水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)的復(fù)制增殖。而用siRNA干擾USP4表達(dá)后會得到相反的結(jié)果。另外,USP4可以與RIG-Ⅰ直接相互作用并特異性去除其K48偶聯(lián)的泛素鏈。 因此,我們提出,USP4作為RIG-Ⅰ的一個(gè)新的調(diào)節(jié)分子,通過其去泛素化酶活性去除RIG-Ⅰ K48偶聯(lián)的泛素鏈來穩(wěn)定RIG-Ⅰ的表達(dá),從而正向調(diào)節(jié)其下游信號通路。 研究目的： 1、閘明USP4在RIG-Ⅰ信號通路中的功能； 2、找出USP4的作用靶點(diǎn)及機(jī)制； 3、探討USP4在細(xì)胞抗病毒反應(yīng)中的作用。 研究方法： 1、在不同細(xì)胞中檢測RIG-Ⅰ的活化對USP4的表達(dá)的影響。 1.1、在Hela細(xì)胞中檢測RIG-Ⅰ活化對USP4表達(dá)的影響。 a.Ⅰ在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染poly(I:C)0,2,4,8,12h,RT-PCR檢測USP4的表達(dá)(mRNA水平)；Ⅱ在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染poly(I:C)0,12,24,36h,Western blot檢測USP4的表達(dá)(蛋白水平)。 b.Ⅰ用SeV(Sendai virus,仙臺病毒)刺激Hela細(xì)胞0,8,12,24h,RT-PCR檢測USP4的表達(dá)(mRNA水平)；Ⅱ用SeV刺激Hela細(xì)胞0,8,12,24,36h,Western blot檢測USP4的表達(dá)(蛋白水平)。 1.2在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中檢測RIG-Ⅰ活化對USP4表達(dá)的影響。提取小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞, ⅠSeV刺激0,4,8,12,24h,RT-PCR檢測USP4的表達(dá)(mRNA水平)； ⅡSeV刺激0,12,24,36h,Western blot檢測USP4的表達(dá)(蛋白水平)。 2、表達(dá)變化的USP4對RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β表達(dá)的影響。 2.1mRNA水平檢測表達(dá)變化的USP4對RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β表達(dá)的影響。 a.在HEK293細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)�；騏SP4的高表達(dá)質(zhì)粒24h后,再分別轉(zhuǎn)染poly(I:C)或poly(dA:dT)12h,RT-PCR檢測IFN-β的表達(dá)。 b.Ⅰ在HEK293或Hela細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Ctrl siRN八或USI'4siRNA36h后,再轉(zhuǎn)染poly(I:C)0,4h,811,RT-PCR檢測IFN-β的表達(dá)。Ⅱ在HEK293或Hela細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Ctrl siRN八或USP4siRNA36h后,再轉(zhuǎn)染poly(dA:dT)0,16h,RT-PCR檢測IFN-β的表達(dá)。Ⅲ在Hela細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Ctrl siRN八或USP4siRNA36h后,SeV刺激0,12h,RT-PCR檢測IFN-β的表達(dá)。 2.2檢測表達(dá)變化的USP4對RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β和IRF3報(bào)告基因活性的影響。 a.在Hela細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染空白質(zhì)�；騏SP4的高表達(dá)質(zhì)粒和IFN-β、IRF3的報(bào)告基因質(zhì)粒,SeV刺激12h后檢測報(bào)告基因活性差異。 b.在Hela細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Ctrl siRNA或USP4siRNA,再分別轉(zhuǎn)染IFN-β、 IRF3的報(bào)告基因質(zhì)粒,SeV刺激12h后檢測報(bào)告基因活性差異。 3、確定USP4的作用靶點(diǎn)。 3.1mRNA水平檢測表達(dá)變化的USP4對RIG-Ⅰ信號通路中各接頭分子介導(dǎo)的IFN-β表達(dá)的影響。 a.在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染空白質(zhì)�；騏SP4的高表達(dá)質(zhì)粒和RIG-Ⅰ， MAVS, TBK1, IRF35D, TRIF, IKK-ε, MDA5的表達(dá)質(zhì)粒24h, RT-PCR檢測IFN-β的表達(dá)。 b.在HEK293細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Ctrl siRNA或USP4siRNA24h后,再分別轉(zhuǎn)染RIG-Ⅰ, MAVS, TBK1, IRF35D, MDA5的表達(dá)質(zhì)粒24h, RT-PCR檢測IFN-β的表達(dá)。 c.在Huh7.5細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染空白質(zhì)�；騏SP4的高表達(dá)質(zhì)粒和RIG-I,MAVS,TBK1,IRF35D的表達(dá)質(zhì)粒24h,RT-PCR檢測IFN-β的表達(dá)。 3.2檢測USP4高表達(dá)對RIG-I信號通路中各接頭分子介導(dǎo)的IFN-β和IRF3報(bào)告基因活性的影響。 在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒或USP4的高表達(dá)質(zhì)粒和TRIF, RIG-Ⅰ, MAVS, TBK1, IRF35D的表達(dá)質(zhì)粒與IFN-β、IRF3的報(bào)告基因質(zhì)粒,24h后檢測報(bào)告基因活性差異。 3.3蛋白水平檢測表達(dá)變化的USP4對各接頭分子表達(dá)的影響。 a.在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染不同劑量的空白質(zhì)�；騏SP4的高表達(dá)質(zhì)粒和RIG-Ⅰ, MAVS, STING TBK1, IRF3, IKK-ε, MDA5的表達(dá)質(zhì)粒,Western Blot檢測各接頭分子的表達(dá)情況。 b.在Hela細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Ctrl siRNA或USP4siRNA36h, Western Blot檢測內(nèi)源性的RIG-Ⅰ, MAVS和TBK1的表達(dá)情況。 4、USP4調(diào)控RIG-I信號通路的分子機(jī)制研究。 4.1根據(jù)前面的結(jié)果,免疫共沉淀明確USP4與RIG-Ⅰ、MAVS、TBK1等相關(guān)靶分子的結(jié)合情況。 a.在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染帶有Myc標(biāo)簽的USP4質(zhì)粒和帶有Flag標(biāo)簽的RIG-Ⅰ、MAVS等質(zhì)粒,分別用相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫沉淀檢測其相互結(jié)合情況。 b.在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染poly(I:C)0,8,12h,免疫沉淀結(jié)合Western Blot檢測內(nèi)源性的USP4與RIG-Ⅰ、MAVS等信號分子的結(jié)合情況。 c.在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染USP4各節(jié)段質(zhì)粒和RIG-Ⅰ、MAVS等質(zhì)粒,免疫共沉淀檢測各節(jié)段與靶分子的結(jié)合情況,明確USP4與靶分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。 4.2USP4對相應(yīng)靶分子泛素化的影響。 a.靶分子表達(dá)質(zhì)粒、USP4表達(dá)質(zhì)粒或空白質(zhì)粒分別與泛素質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測USP4對靶分子泛素化的影響。 b.靶分子表達(dá)質(zhì)粒、USP4表達(dá)質(zhì)�；蚩瞻踪|(zhì)粒分別與泛素質(zhì)粒野生型或突變體(K48突變體、K63突變體)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測USP4對靶分子泛素化形成(K48或K63)的影響。 c.在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染Ctrl siRNA或USP4siRNA后,再共轉(zhuǎn)染靶分子表達(dá)質(zhì)粒和泛素質(zhì)粒野生型或突變體(K48突變體、K63突變體),免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測USP4對靶分子泛素化形式(K48或K63)的影響。 d.在Hela細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Ctrl siRNA或USP4siRNA, SeV刺激4h后,免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測USP4對內(nèi)源性靶分子泛素化的影響,同時(shí)明確泛素化形式(K48或K63)。 5、USP4在抗病毒感染中的功能研究。 a.在HEK293細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒或USP4的高表達(dá)質(zhì)粒24h后,用VSV感染細(xì)胞,檢測VSV的復(fù)制情況。(空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測病毒滴度；實(shí)時(shí)定量PCR檢測細(xì)胞中VSV mRNA) b.在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染Ctrl siRNA或USP4siRNA48h后,用VSV感染細(xì)胞,檢測VSV的復(fù)制情況。(空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測病毒滴度,實(shí)時(shí)定量PCR檢測細(xì)胞中VSV mRNA) 研究結(jié)果： 1、RIG-Ⅰ信號通路的活化能夠抑制USP4的表達(dá)。 a.用poly(I:C)轉(zhuǎn)染或SeV刺激Hela細(xì)胞以激活RIG-Ⅰ信號通路后,USP4的表達(dá)被明顯抑制(mRNA水平和蛋白水平)。 b.用SeV刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞,USP4的表達(dá)也明顯降低(mRNA水平和蛋白水平)。 2、USP4可以顯著增強(qiáng)RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)。 a.在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染USP4的高表達(dá)質(zhì)粒后,轉(zhuǎn)染poly(I:C)或poly(dA：dT)(活化RIG-Ⅰ信號通路)誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)明顯上調(diào)。 b.特異性小干擾RNA抑制HEK293細(xì)胞或Hela細(xì)胞中內(nèi)源性USP4的表達(dá),轉(zhuǎn)染poly(I:C)或poly(dA:dT)誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)被明顯抑制。 c.特異性小干擾RNA抑制Hela細(xì)胞中內(nèi)源性USP4的表達(dá),可顯著抑制SeV誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)。 d.在Hela細(xì)胞中,USP4的高表達(dá)可明顯增強(qiáng)SeV介導(dǎo)的IFN-β和IRF3報(bào)告基因的活化；特異性小干擾RNA抑制USP4的表達(dá)后,SeV介導(dǎo)的IFN-β和IRF3報(bào)告基因活化被顯著抑制。 3、USP4靶向作用于RIG-Ⅰ。 3.1USP4特異性調(diào)控RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β表達(dá)(mRNA水平)。 a.USP4的過表達(dá)可明顯增強(qiáng)HEK293細(xì)胞中RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β表達(dá)(mRNA水平),而對其下游信號分子MAVS, STING, TBK1和接頭蛋白MDA5介導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)無明顯影響。在RIG-Ⅰ缺陷的Huh7.5細(xì)胞中結(jié)果類似。 b.特異性小干擾RNA抑制HEK293細(xì)胞中內(nèi)源性USP4的表達(dá),可顯著抑制RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β表達(dá)(mRNA水平),但對其下游信號分子MAVS, STING, TBK1, IRF3, IKK-ε和接頭蛋白MDA5介導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)作用不大。 3.2USP4特異性調(diào)控RIG-Ⅰ介導(dǎo)IFN-β及IRF3的報(bào)告基因活化。 USP4的過表達(dá)可明顯增強(qiáng)HEK293細(xì)胞中RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β及IRF3的報(bào)告基因活化,而對其下游信號分子MAVS，TBK1，IRF3及接頭分子TRIF介導(dǎo)的IFN-β及IRF3的報(bào)告基因活化無明顯作用。 3.3USP4特異性增強(qiáng)RIG-Ⅰ的表達(dá)。 a.在HEK293細(xì)胞中,USP4的過表達(dá)能夠顯著上調(diào)外源性RIG-Ⅰ的表達(dá),且具有劑量依賴性；而對于外源性MAVS,STING、TBK1,IRF3,IKK-ε, MDA5的表達(dá)無明顯影響。 b.特異性小干擾RNA抑制Hela細(xì)胞中內(nèi)源性USP4的表達(dá),可顯著并抑制內(nèi)源性RIG-Ⅰ的表達(dá),而對內(nèi)源州MAVS.TBK1的表達(dá)無明顯作用。 4.USP4可以特異性與RIG-Ⅰ相結(jié)合。 4.1USP4可以與RIG-Ⅰ相互結(jié)合。 a.在HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染帶有不同標(biāo)簽的USP4和RIG-Ⅰ的表達(dá)質(zhì)粒,分別用相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫共沉淀,Western Blot的結(jié)果顯示,外源性的USP4和RIG-Ⅰ可以相互結(jié)合。 b.在Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染poly(I:C)不同的時(shí)間點(diǎn)后,用內(nèi)源性的抗體進(jìn)行免疫共沉淀,Western Blot的結(jié)果顯示,內(nèi)源性的USP4和RIG-Ⅰ能夠組成性結(jié)合。 4.2USP4特異性結(jié)合于RIG-Ⅰ的N末端Card結(jié)構(gòu)域。 在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染空白質(zhì)�；騏SP4表達(dá)質(zhì)粒與RIG-Ⅰ僅有N末端兩個(gè)Card結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒RIG-IN,Western Blot的結(jié)果顯示,USP4的過表達(dá)可以顯著增強(qiáng)RIG-IN的表達(dá)；免疫共沉淀結(jié)果表明,USP4可以直接與RIG-IN相結(jié)合。 4.3USP4與RIG-Ⅰ的結(jié)合位點(diǎn)位于其N末端的DUSP結(jié)構(gòu)域。 在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染USP4的不同節(jié)段質(zhì)粒(WT，野生型；N260,C末端USP結(jié)構(gòu)域缺失：C261,N末端DUSP結(jié)構(gòu)域缺失)與RIG-Ⅰ表達(dá)質(zhì)粒,免疫共沉淀結(jié)果表明,RIG-Ⅰ與WT,N260可以相結(jié)合,但是與C261末檢測到結(jié)合。 5.USP4可以特異性移除RIG-Ⅰ的K48-偶聯(lián)的泛素鏈。 5.1USP4的過表達(dá)可特異性下調(diào)RIG-ⅠK48-偶聯(lián)的體外泛素化作用。 a. RIG-Ⅰ表達(dá)質(zhì)粒、USP4表達(dá)質(zhì)�；蚩瞻踪|(zhì)粒分別與泛素粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,免疫共沉淀結(jié)果表明,USP4過表達(dá)能明顯下調(diào)RIG-Ⅰ的體外泛素化作用。 b. RIG-Ⅰ表達(dá)質(zhì)粒、USP4表達(dá)質(zhì)粒或空白質(zhì)粒分別與泛素質(zhì)粒野生型或突變體(K48突變體、K63突變體)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,免疫共沉淀結(jié)果顯示,USP4過表達(dá)可特異性下調(diào)RIG-Ⅰ的K48偶聯(lián)的泛素化。同時(shí),USP4對于MAVS的體外泛素化作用無明顯影響。 5.2特異性小干擾RNA抑制HEK293細(xì)胞中內(nèi)源性USP4的表達(dá),可顯著上調(diào)RIG-ⅠK48-偶聯(lián)的體外泛素化作用。 a.在HEK293細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染Ctrl siRNA或USP4siRNA后,再共轉(zhuǎn)染RIG-I表達(dá)質(zhì)粒和泛素質(zhì)粒野生型或突變體(K48突變體、K63突變體),免疫共沉淀結(jié)果顯示,USP4的低表達(dá)能特異性增強(qiáng)RIG-Ⅰ K48-偶聯(lián)的體外泛素化作用。 b.小干擾RNA抑制Hela細(xì)胞中內(nèi)源性USP4的表達(dá),可顯著上調(diào)SeV刺激誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ內(nèi)源性泛素化作用,同時(shí)其K48-偶聯(lián)的泛素化作用也明顯增強(qiáng)。 6.USP4參與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。USP4的過表達(dá)能明顯抑制VSV病毒在HEK293細(xì)胞中的復(fù)制；而用小干擾RNA抑制內(nèi)源性USP4的表達(dá)后能顯著促進(jìn)VSV病毒在胞內(nèi)的復(fù)制。 結(jié)論： 1、RIG-Ⅰ信號通路的活化能夠抑制USP4的表達(dá)。 2、USP4能特異性增強(qiáng)RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)。 3、USP4可以與RIG-β相結(jié)合并通過去泛素化酶活性去除其K48-偶聯(lián)的泛素鏈來穩(wěn)定RIG-β的表達(dá),從而正向調(diào)節(jié)其下游信號通路。 4、USP4參與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。 創(chuàng)新點(diǎn)及意義： 1、本研究首次提出,USP4作為RIG-Ⅰ的一個(gè)新的調(diào)節(jié)分子,通過其去泛素化酶活性去除RIG-Ⅰ K48偶聯(lián)的泛素鏈來穩(wěn)定RIG-Ⅰ的表達(dá),從而正向調(diào)節(jié)其下游信號通路。 2、本研究為正向調(diào)控RLR信號通路提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為抗病毒研究、診斷和治療提供新的思路。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號說明
前言
材料方法
    1.材料
    2.方法
結(jié)果
    1、RIG-I信號通路的活化能夠抑制USP4的表達(dá)
    2、USP4可以顯著増強(qiáng)RIG-I介導(dǎo)的IFN-P旳表達(dá)
    3、USP4鞭向作用于RIG-I
    4、USP4可以特異性與RIG-I相結(jié)合
    5、USP4可以特異性移除RIG-I的K48-偶聯(lián)的泛素鏈
    6.USP4參與細(xì)胞抗病毒反應(yīng)
討論
結(jié)論
附圖
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
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7 涂華玉;組蛋白H2B泛素化修飾在減數(shù)分裂過程中作用的初步研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2011年

8 劉兵;膽甾衍生物的設(shè)計(jì)，合成及其促HMGCR泛素化降解的活性研究[D];華東師范大學(xué);2010年

9 尹翔;肌小節(jié)Z線蛋白Cypher泛素化降解的初步研究[D];浙江大學(xué);2013年

10 劉甜;泛素特異性蛋白酶USP26突變型去泛素化酶活性檢測[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2888064