登革病毒(Dengue Virus, DENV)是一種通過蚊子(以埃及伊蚊和白紋伊蚊為主)傳播的病毒,屬于黃病毒屬的黃病毒科。DENV含有四個血清型：DENV1, DENV2, DENV3及DENV4。各種血清型的DENV之間存在60-70%的同源序列。人類感染了DENV的其中任何一種血清型后將引發(fā)從輕度自限性登革熱(Dengue Fever, DF)到重度甚至死亡的登革出血熱(Dengue Hemorrhagic Fever, DHF)及登革休克綜合征(Dengue Shock Syndrome, DSS)。 目前,對于登革熱的研究已經(jīng)持續(xù)進行了60多年,仍然沒有安全有效的疫苗及治療藥物得以認證使用,因而近年來登革熱已逐漸成為影響全球熱帶及亞熱帶地區(qū)的主要公共衛(wèi)生問題。每年世界上大約有5000萬-1億人感染DENV,其中大約50萬人會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥從而引發(fā)2.5萬人死亡。機體初次感染任一血清型的DENV所誘發(fā)的抗體能夠中和同一血清型的再次感染,但是當機體再次感染其他三種不同的血清型時,此異型中和抗體會促進Fcγ受體陽性細胞內(nèi)病毒的攝入及復(fù)制,引發(fā)抗體依賴增強作用(antibody-dependent enhancement, ADE),從而誘發(fā)登革熱嚴重的并發(fā)癥如DHF/DSS等。ADE作用的存在是登革熱疫苗研發(fā)的主要障礙。因此,如果能夠?qū)贵w誘導(dǎo)中和作用的機制及抗原位點有了全面深入的理解,對于疫苗的研發(fā)策略以及臨床試驗中疫苗效果及安全性的評估有著非常重要的意義。 DENV是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組長度大約11kb,編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。三種結(jié)構(gòu)蛋白分別是衣殼蛋白(capsid protein, C),膜蛋白(membrane protein, M)和包膜蛋白(envelope protein, E)。7種非結(jié)構(gòu)蛋白分別為NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。E蛋白是成熟DENV顆粒表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白,作為宿主體液免疫應(yīng)答的主要抗原靶標,在受體的結(jié)合及病毒與細胞膜融合中起著關(guān)鍵性的作用。在病毒進入宿主細胞的過程中,內(nèi)涵圖環(huán)境的酸性化觸發(fā)了病毒表面的E蛋白二聚體發(fā)生構(gòu)象變化成為三聚體,該變化誘發(fā)了病毒與宿主細胞膜的融合,最終使得DENV的RNA基因組釋放進入細胞質(zhì)并啟動了病毒的感染。目前人們已經(jīng)通過結(jié)晶學(xué)(Crystallography)技術(shù)對蟲媒病毒及蜱傳腦炎的E蛋白進行了結(jié)構(gòu)學(xué)分析,病毒顆粒表面的E蛋白含有3個結(jié)構(gòu)區(qū)：位于中心的Ⅰ區(qū)(EDⅠ)；含有融合環(huán)(fusion peptide, FP)的延展Ⅱ區(qū)(EDⅡ)；以及呈免疫球蛋白樣折疊的含有10個β-strands (A-G及AxCxDx)的EDⅢ。其中EDⅢ作為一個獨立暴露于病毒表面的區(qū)域,成為了制備保護性單克隆抗體的重要抗原靶標,相關(guān)研究亦表明EDⅢ含有非常重要的中和抗原表位。 在本實驗室的前期工作中,我們用雜交瘤技術(shù)制備了一組抗DENV1-4EDⅢ的單抗,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫熒光試驗(immunofluorescence assay, IFA)和蛋白印跡實驗(western blot,WB)對這些單抗的免疫反應(yīng)性進行了分析,在此基礎(chǔ)上,借助已經(jīng)建立的中和實驗方法學(xué)enzyme-linked immunospot based micro-neutralization test (ELISPOT-MNT)對單抗的中和活性進行檢測,其中2株具備針對DENV1-4較高交叉中和活性的單抗3E31及2D73被選用進行下一步的功能和結(jié)構(gòu)學(xué)分析以期能夠?qū)@2株中和抗體的中和作用機制進行全面深入的了解。 由此,本研究的目的主要有三個,一、尋求一種能夠精確滴定DENV的新方法為后續(xù)的實驗做好準備；二、通過一些功能實驗對交叉中和抗體進行分析；三、借助結(jié)晶學(xué)技術(shù),從結(jié)構(gòu)上分析2株交叉中和抗體的中和作用機制,為登革熱疫苗及治療性藥物的研發(fā)提供幫助。 由此,本研究分為以下三個方面的內(nèi)容： 第一部分：建立基于ELISA的TCID50方法學(xué)(TCID50-ELISA)滴定DENV 在對于DENV的研究中,常常因為不能準確地滴定DENV而受到了阻礙,目前人們建立的DENV滴定方法包含噬斑實驗(plaque assay, PA),半數(shù)組織感染量測定(tissue cultureinfectious dose-50assay, TCID50),熒光焦點實驗以及基于免疫熒光的熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)。作為DENV滴定的金標準,PA及TCID50方法均受到了病毒株的傳代及細胞系的種類的限制,很多DENV臨床分離株并不能在單層細胞上形成噬斑或者肉眼可見的細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE),影響了滴定結(jié)果的判斷。另外,這兩種方法均需要實驗者每天借助顯微鏡進行人工檢測,耗時耗力。而相比之下熒光焦點實驗及FACS能夠更精確快速地進行病毒滴定,缺點是該兩種方法需要具備豐富經(jīng)驗的實驗者及較好的實驗室條件。因而,在我們的研究的最初,為了后續(xù)實驗的順利進行,試圖建立一種全新的DENV滴定方法學(xué)以克服傳統(tǒng)方法的缺陷。NS1蛋白是DENV的一種多功能糖蛋白,也是DENV復(fù)制的主要標志,其主要以分泌及膜表達兩種方式存在,其中分泌的NS1被認為和上清中DENV的滴度相關(guān)。本實驗室在前期的研究中建立了一種NS1抗原捕獲ELISA方法,在本研究中,我們在傳統(tǒng)的TCID50方法學(xué)的基礎(chǔ)上,借助已經(jīng)建立的NS1抗原捕獲ELISA檢測病毒感染上清中的NS1蛋白,以替代傳統(tǒng)方法學(xué)中的肉眼觀察CPE,經(jīng)過分析比較后證實這種TCID50-ELISA方法具備較好的準確性和重復(fù)性,且操作簡便,能夠替代傳統(tǒng)的TCID50-CPE及PA方法學(xué)進行DENV的滴定。 第二部分：四型交叉抗DENV EDⅢ單克隆抗體的功能鑒定 在本實驗室的前期工作中,借助畢赤酵母真核表達體系表達DENV1-4EDⅢ重組蛋白,隨后利用雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備了一組抗DENV1-4EDⅢ的單抗,并對該組抗體的血清型、交叉反應(yīng)性及中和活性進行了鑒定。最終發(fā)現(xiàn)其中2株交叉反應(yīng)性單抗具備針對DENV四個血清型較高的中和活性,命名為3E31及2D73。在本研究中,我們通過一系列相關(guān)實驗對3E31及2D73的功能進行全面的鑒定。首先我們用表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance, SPR)對2株抗體與DENV1-4EDIII及DENV1-4E的親和力進行了進一步的動態(tài)分析。SPR不僅可以檢測出抗EDⅢ單抗與EDⅢ及E蛋白抗原動態(tài)相互作用情況下的平衡解離常數(shù)(equilibrium dissociation constant, KD),而且可以得到EDⅢ單抗和抗原的結(jié)合常數(shù)(association constant,Ka)及解離常數(shù)(dissociation constant, Kd),以及表示抗體可及性(accessibility)的單抗活性百分數(shù)。另外Ka及Kd值也為下一步抗原抗體共結(jié)晶提供了指導(dǎo)意義。結(jié)果顯示這2株單抗的親和力很高均達到了nM水平,且針對四個血清型EDⅢ抗原的親和力無明顯差異,結(jié)合中和實驗的結(jié)果,并未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相互關(guān)系。更為重要的是,在膜融合抑制實驗中,3E31顯示出了抑制融合作用,而2D73卻表現(xiàn)出了顯著的膜融合增強作用,這一現(xiàn)象到目前為止從未被報道過。最后,我們對這2株交叉中和單抗的ADE活性進行了鑒定,結(jié)果顯示它們顯示出了不同的ADE活性,單抗3E31不會引發(fā)針對四個血清型DENV的感染增強作用,而單抗2D73卻能夠在DENV2, DENV3及DENV4的感染后引發(fā)ADE作用�；谝陨系墓δ荑b定結(jié)果,我們推測單抗3E31及2D73的中和作用機制可能不同。 第三部分：結(jié)晶學(xué)技術(shù)分析四型交叉抗DENV EDⅢ中和抗體的中和作用機制 為了對單抗2D73及3E31的中和作用機制進行更深入的探討,將抗體的Fab段與E蛋白Ⅲ區(qū)抗原進行共結(jié)晶,獲取晶體后通過X-ray衍射后分別獲取了2組高分辨率的結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù),分辨率分別為2.2A及2.0A。通過軟件對數(shù)據(jù)進行三維立體結(jié)構(gòu)學(xué)分析,最終確定該2株單抗結(jié)合的抗原表位。結(jié)果顯示這2株單抗識別了2個不同但稍有重疊的表位。單抗3E31的抗原表位主要集中于ABloop及E strand。其中形成氫鍵及鹽橋的氨基酸在DENV四個血清型中完全保守,這解釋了該單抗具備四型交叉中和能力。單抗2D73識別的表位主要集中于Astrand及G strand,這些氨基酸同樣在DENV四個血清型中高度保守。通過與目前已發(fā)表的其他相關(guān)結(jié)構(gòu)進行比較后發(fā)現(xiàn),3E31識別的表位與單抗2H12相同,而2D73的表位則與單抗4E11、1A1D-2所識別的表位非常接近,人們把這類單抗稱為"A strand"單抗。隨后,通過對2D73表位及3E31表位在完整DENV顆粒表面的融合前E蛋白二聚體表面暴露情況進行分析,發(fā)現(xiàn)3E31表位完全隱藏于病毒顆粒內(nèi)部,而2D73表位僅有極小部分暴露在外。那么該2株抗體是如何結(jié)合完整病毒并進行中和作用的?而當E蛋白二聚體經(jīng)過構(gòu)象變化轉(zhuǎn)變?yōu)槿垠w后,3E31表位仍然隱藏,2D73表位卻大部分暴露,該結(jié)果與功能研究中的膜融合抑制實驗結(jié)果相呼應(yīng)。結(jié)合功能實驗的結(jié)果,我們最終對2株四型交叉中和單抗3E31及2D73的中和作用機制進行了深入明了的闡述,并進一步為抗DENV疫苗及治療性藥物的研發(fā)提供了新的思路,同時也為理解ADE的發(fā)生機制提供了幫助。 小結(jié) 通過以上三部分的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),本研究的具有以下三個創(chuàng)新之處,其中包括： 一、利用我們建立的DENV特異性NSl抗原捕獲ELISA,建立了一種新的基于傳統(tǒng)TCID50測定的TCID50-ELISA方法學(xué),在6天時間內(nèi)對DENV1-4進行精確的滴定。TCID50-ELISA方法不僅顯示出了與傳統(tǒng)的噬斑實驗及TCID50結(jié)果的一致性,還具備較好的重復(fù)性。原因在于我們通過檢測NS1蛋白替代CPE的觀察,從而排除了不同操作者及實驗室?guī)淼闹饔^差異。另外,TCID50-ELISA方法還克服了傳統(tǒng)的噬斑實驗及TCID50-CPE方法學(xué)的缺點,能夠同時運用于C6/36, Vero E6, BHK-21及Vero cells等不同的敏感細胞株,且不受細胞株狀態(tài)的影響。另外,TCID50-ELISA方法亦能夠?qū)εR床分離株進行精確的滴定。基于很好的準確度和重復(fù)性,TCID50-ELISA可以替代傳統(tǒng)的方法對DENV進行滴定,對登革熱的研究起到了促進作用。 二、在本研究中,我們通過一些功能實驗對2株抗EDⅢ交叉反應(yīng)中和抗體3E31及2D73進行了鑒定。2株單抗均能中和DENV四個血清型的感染,且單抗與DENV結(jié)合的親和力及中和能力呈溫度依賴性。這兩株單抗在膜融合抑制實驗及ADE實驗中均表現(xiàn)出了不同的作用,提示二者的中和作用機制可能并不相同。本研究發(fā)現(xiàn)抗病毒中和抗體2D73能夠在病毒與細胞膜融合過程中起到增強作用,據(jù)我們所知,過去并未出現(xiàn)相關(guān)報道。這一新發(fā)現(xiàn)為后續(xù)人們對抗病毒中和抗體的功能研究提供了新思路。另外,研究發(fā)現(xiàn)中和單抗3E31不具備ADE活性,提示此抗體具備成為免疫治療性抗體的潛在可能性。 三、為了對中和單抗3E31及2D73的中和作用機制的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)進行研究,本研究中,我們通過結(jié)晶學(xué)技術(shù)將單抗的Fab段與EDⅢ蛋白進行抗原抗體的共結(jié)晶。通過X-ray對晶體進行衍射后,收集高分辨率的數(shù)據(jù)進行三維立體晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)分析。根據(jù)最終解析的抗原抗體結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu),我們對單抗3E31和2D73所識別的抗原表位有了清晰立體的了解。隨后,我們通過模型模擬分析這2個表位分別在融合前E蛋白二聚體全長及融合后三聚體的暴露程度,以及單抗在等病毒生命周期內(nèi)的不同形態(tài)下(未成熟及成熟顆粒)的結(jié)合情況。通過以上的結(jié)構(gòu)分析,結(jié)合前期的功能研究,我們對單抗3E31和2D73的中和作用機制及ADE發(fā)生機制進行了深入的探討,彌補了目前人們對這兩方面理解的不足,對登革熱研究中有效疫苗的研發(fā)和評估非常關(guān)鍵。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R373.33;R3416
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
    參考文獻
50)檢測方法滴定登革病毒'>第一部分 建立基于ELISA的半數(shù)組織感染劑量(TCID₅₀)檢測方法滴定登革病毒
    1 材料和方法
        1.1 試劑與材料
        1.2 方法
    2 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果
        3.1 確定TCID50-ELISA方法孵育時間點
        3.2 TCID50-ELISA,TCID50-CPE及噬斑實驗的定量及定性比較
    4 討論
    5 參考文獻
第二部分 登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)中和抗體的功能研究
    1 材料和方法
        1.1 試劑與材料
    2 結(jié)果
        2.1 抗DENV EDin單克隆抗體的制備及鑒定
        2.2 表面等離子共振技術(shù)（SPR）動態(tài)分析登革病毒EDⅢ單克隆抗體的親和力
        2.3 單抗3E31與2D73在病毒與細胞膜融合中所起到的作用
        2.4 單抗3E31及2D73與DENV的親和力及中和活性呈溫度依賴性
        2.5 抗EDⅢ單抗的抗體依賴增強作用（ADE）分析
    3 討論
    4 參考文獻
第三部分 登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)中和抗體的結(jié)構(gòu)研究
    1 材料和方法
        1.1 主要試劑和材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果
        2.1 Fab及Fab-EDⅢ抗原抗體復(fù)合物的制備及純化
        2.2 Fab 3E31-EDⅢ及Fab 2D73-EDⅢ結(jié)晶體條件的優(yōu)化
        2.3 Fab 3E31-EDⅢ及Fab 2D73-EDⅢ結(jié)晶體特性
        2.4 單抗3E31及2D73與抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)學(xué)分析
        2.5 結(jié)構(gòu)學(xué)數(shù)據(jù)分析抗EDⅢ單抗ADE作用機制
        2.6 結(jié)構(gòu)學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合功能研究結(jié)果分析抗EDⅢ單抗的中和作用機制
    3 討論
    4 參考文獻
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綜述
    參考文獻
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致謝
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本文編號：2861326