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登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)中和抗體的功能及結(jié)構(gòu)分析

發(fā)布時(shí)間:2020-10-29 19:08
   登革病毒(Dengue Virus, DENV)是一種通過蚊子(以埃及伊蚊和白紋伊蚊為主)傳播的病毒,屬于黃病毒屬的黃病毒科。DENV含有四個(gè)血清型:DENV1, DENV2, DENV3及DENV4。各種血清型的DENV之間存在60-70%的同源序列。人類感染了DENV的其中任何一種血清型后將引發(fā)從輕度自限性登革熱(Dengue Fever, DF)到重度甚至死亡的登革出血熱(Dengue Hemorrhagic Fever, DHF)及登革休克綜合征(Dengue Shock Syndrome, DSS)。 目前,對(duì)于登革熱的研究已經(jīng)持續(xù)進(jìn)行了60多年,仍然沒有安全有效的疫苗及治療藥物得以認(rèn)證使用,因而近年來登革熱已逐漸成為影響全球熱帶及亞熱帶地區(qū)的主要公共衛(wèi)生問題。每年世界上大約有5000萬-1億人感染DENV,其中大約50萬人會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥從而引發(fā)2.5萬人死亡。機(jī)體初次感染任一血清型的DENV所誘發(fā)的抗體能夠中和同一血清型的再次感染,但是當(dāng)機(jī)體再次感染其他三種不同的血清型時(shí),此異型中和抗體會(huì)促進(jìn)Fcγ受體陽性細(xì)胞內(nèi)病毒的攝入及復(fù)制,引發(fā)抗體依賴增強(qiáng)作用(antibody-dependent enhancement, ADE),從而誘發(fā)登革熱嚴(yán)重的并發(fā)癥如DHF/DSS等。ADE作用的存在是登革熱疫苗研發(fā)的主要障礙。因此,如果能夠?qū)贵w誘導(dǎo)中和作用的機(jī)制及抗原位點(diǎn)有了全面深入的理解,對(duì)于疫苗的研發(fā)策略以及臨床試驗(yàn)中疫苗效果及安全性的評(píng)估有著非常重要的意義。 DENV是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組長度大約11kb,編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。三種結(jié)構(gòu)蛋白分別是衣殼蛋白(capsid protein, C),膜蛋白(membrane protein, M)和包膜蛋白(envelope protein, E)。7種非結(jié)構(gòu)蛋白分別為NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。E蛋白是成熟DENV顆粒表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白,作為宿主體液免疫應(yīng)答的主要抗原靶標(biāo),在受體的結(jié)合及病毒與細(xì)胞膜融合中起著關(guān)鍵性的作用。在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中,內(nèi)涵圖環(huán)境的酸性化觸發(fā)了病毒表面的E蛋白二聚體發(fā)生構(gòu)象變化成為三聚體,該變化誘發(fā)了病毒與宿主細(xì)胞膜的融合,最終使得DENV的RNA基因組釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并啟動(dòng)了病毒的感染。目前人們已經(jīng)通過結(jié)晶學(xué)(Crystallography)技術(shù)對(duì)蟲媒病毒及蜱傳腦炎的E蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)學(xué)分析,病毒顆粒表面的E蛋白含有3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū):位于中心的Ⅰ區(qū)(EDⅠ);含有融合環(huán)(fusion peptide, FP)的延展Ⅱ區(qū)(EDⅡ);以及呈免疫球蛋白樣折疊的含有10個(gè)β-strands (A-G及AxCxDx)的EDⅢ。其中EDⅢ作為一個(gè)獨(dú)立暴露于病毒表面的區(qū)域,成為了制備保護(hù)性單克隆抗體的重要抗原靶標(biāo),相關(guān)研究亦表明EDⅢ含有非常重要的中和抗原表位。 在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中,我們用雜交瘤技術(shù)制備了一組抗DENV1-4EDⅢ的單抗,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)(immunofluorescence assay, IFA)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(western blot,WB)對(duì)這些單抗的免疫反應(yīng)性進(jìn)行了分析,在此基礎(chǔ)上,借助已經(jīng)建立的中和實(shí)驗(yàn)方法學(xué)enzyme-linked immunospot based micro-neutralization test (ELISPOT-MNT)對(duì)單抗的中和活性進(jìn)行檢測,其中2株具備針對(duì)DENV1-4較高交叉中和活性的單抗3E31及2D73被選用進(jìn)行下一步的功能和結(jié)構(gòu)學(xué)分析以期能夠?qū)@2株中和抗體的中和作用機(jī)制進(jìn)行全面深入的了解。 由此,本研究的目的主要有三個(gè),一、尋求一種能夠精確滴定DENV的新方法為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備;二、通過一些功能實(shí)驗(yàn)對(duì)交叉中和抗體進(jìn)行分析;三、借助結(jié)晶學(xué)技術(shù),從結(jié)構(gòu)上分析2株交叉中和抗體的中和作用機(jī)制,為登革熱疫苗及治療性藥物的研發(fā)提供幫助。 由此,本研究分為以下三個(gè)方面的內(nèi)容: 第一部分:建立基于ELISA的TCID50方法學(xué)(TCID50-ELISA)滴定DENV 在對(duì)于DENV的研究中,常常因?yàn)椴荒軠?zhǔn)確地滴定DENV而受到了阻礙,目前人們建立的DENV滴定方法包含噬斑實(shí)驗(yàn)(plaque assay, PA),半數(shù)組織感染量測定(tissue cultureinfectious dose-50assay, TCID50),熒光焦點(diǎn)實(shí)驗(yàn)以及基于免疫熒光的熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。作為DENV滴定的金標(biāo)準(zhǔn),PA及TCID50方法均受到了病毒株的傳代及細(xì)胞系的種類的限制,很多DENV臨床分離株并不能在單層細(xì)胞上形成噬斑或者肉眼可見的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE),影響了滴定結(jié)果的判斷。另外,這兩種方法均需要實(shí)驗(yàn)者每天借助顯微鏡進(jìn)行人工檢測,耗時(shí)耗力。而相比之下熒光焦點(diǎn)實(shí)驗(yàn)及FACS能夠更精確快速地進(jìn)行病毒滴定,缺點(diǎn)是該兩種方法需要具備豐富經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)者及較好的實(shí)驗(yàn)室條件。因而,在我們的研究的最初,為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行,試圖建立一種全新的DENV滴定方法學(xué)以克服傳統(tǒng)方法的缺陷。NS1蛋白是DENV的一種多功能糖蛋白,也是DENV復(fù)制的主要標(biāo)志,其主要以分泌及膜表達(dá)兩種方式存在,其中分泌的NS1被認(rèn)為和上清中DENV的滴度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中建立了一種NS1抗原捕獲ELISA方法,在本研究中,我們?cè)趥鹘y(tǒng)的TCID50方法學(xué)的基礎(chǔ)上,借助已經(jīng)建立的NS1抗原捕獲ELISA檢測病毒感染上清中的NS1蛋白,以替代傳統(tǒng)方法學(xué)中的肉眼觀察CPE,經(jīng)過分析比較后證實(shí)這種TCID50-ELISA方法具備較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,且操作簡便,能夠替代傳統(tǒng)的TCID50-CPE及PA方法學(xué)進(jìn)行DENV的滴定。 第二部分:四型交叉抗DENV EDⅢ單克隆抗體的功能鑒定 在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中,借助畢赤酵母真核表達(dá)體系表達(dá)DENV1-4EDⅢ重組蛋白,隨后利用雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備了一組抗DENV1-4EDⅢ的單抗,并對(duì)該組抗體的血清型、交叉反應(yīng)性及中和活性進(jìn)行了鑒定。最終發(fā)現(xiàn)其中2株交叉反應(yīng)性單抗具備針對(duì)DENV四個(gè)血清型較高的中和活性,命名為3E31及2D73。在本研究中,我們通過一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)3E31及2D73的功能進(jìn)行全面的鑒定。首先我們用表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance, SPR)對(duì)2株抗體與DENV1-4EDIII及DENV1-4E的親和力進(jìn)行了進(jìn)一步的動(dòng)態(tài)分析。SPR不僅可以檢測出抗EDⅢ單抗與EDⅢ及E蛋白抗原動(dòng)態(tài)相互作用情況下的平衡解離常數(shù)(equilibrium dissociation constant, KD),而且可以得到EDⅢ單抗和抗原的結(jié)合常數(shù)(association constant,Ka)及解離常數(shù)(dissociation constant, Kd),以及表示抗體可及性(accessibility)的單抗活性百分?jǐn)?shù)。另外Ka及Kd值也為下一步抗原抗體共結(jié)晶提供了指導(dǎo)意義。結(jié)果顯示這2株單抗的親和力很高均達(dá)到了nM水平,且針對(duì)四個(gè)血清型EDⅢ抗原的親和力無明顯差異,結(jié)合中和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,并未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相互關(guān)系。更為重要的是,在膜融合抑制實(shí)驗(yàn)中,3E31顯示出了抑制融合作用,而2D73卻表現(xiàn)出了顯著的膜融合增強(qiáng)作用,這一現(xiàn)象到目前為止從未被報(bào)道過。最后,我們對(duì)這2株交叉中和單抗的ADE活性進(jìn)行了鑒定,結(jié)果顯示它們顯示出了不同的ADE活性,單抗3E31不會(huì)引發(fā)針對(duì)四個(gè)血清型DENV的感染增強(qiáng)作用,而單抗2D73卻能夠在DENV2, DENV3及DENV4的感染后引發(fā)ADE作用;谝陨系墓δ荑b定結(jié)果,我們推測單抗3E31及2D73的中和作用機(jī)制可能不同。 第三部分:結(jié)晶學(xué)技術(shù)分析四型交叉抗DENV EDⅢ中和抗體的中和作用機(jī)制 為了對(duì)單抗2D73及3E31的中和作用機(jī)制進(jìn)行更深入的探討,將抗體的Fab段與E蛋白Ⅲ區(qū)抗原進(jìn)行共結(jié)晶,獲取晶體后通過X-ray衍射后分別獲取了2組高分辨率的結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù),分辨率分別為2.2A及2.0A。通過軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行三維立體結(jié)構(gòu)學(xué)分析,最終確定該2株單抗結(jié)合的抗原表位。結(jié)果顯示這2株單抗識(shí)別了2個(gè)不同但稍有重疊的表位。單抗3E31的抗原表位主要集中于ABloop及E strand。其中形成氫鍵及鹽橋的氨基酸在DENV四個(gè)血清型中完全保守,這解釋了該單抗具備四型交叉中和能力。單抗2D73識(shí)別的表位主要集中于Astrand及G strand,這些氨基酸同樣在DENV四個(gè)血清型中高度保守。通過與目前已發(fā)表的其他相關(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),3E31識(shí)別的表位與單抗2H12相同,而2D73的表位則與單抗4E11、1A1D-2所識(shí)別的表位非常接近,人們把這類單抗稱為"A strand"單抗。隨后,通過對(duì)2D73表位及3E31表位在完整DENV顆粒表面的融合前E蛋白二聚體表面暴露情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)3E31表位完全隱藏于病毒顆粒內(nèi)部,而2D73表位僅有極小部分暴露在外。那么該2株抗體是如何結(jié)合完整病毒并進(jìn)行中和作用的?而當(dāng)E蛋白二聚體經(jīng)過構(gòu)象變化轉(zhuǎn)變?yōu)槿垠w后,3E31表位仍然隱藏,2D73表位卻大部分暴露,該結(jié)果與功能研究中的膜融合抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果相呼應(yīng)。結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們最終對(duì)2株四型交叉中和單抗3E31及2D73的中和作用機(jī)制進(jìn)行了深入明了的闡述,并進(jìn)一步為抗DENV疫苗及治療性藥物的研發(fā)提供了新的思路,同時(shí)也為理解ADE的發(fā)生機(jī)制提供了幫助。 小結(jié) 通過以上三部分的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),本研究的具有以下三個(gè)創(chuàng)新之處,其中包括: 一、利用我們建立的DENV特異性NSl抗原捕獲ELISA,建立了一種新的基于傳統(tǒng)TCID50測定的TCID50-ELISA方法學(xué),在6天時(shí)間內(nèi)對(duì)DENV1-4進(jìn)行精確的滴定。TCID50-ELISA方法不僅顯示出了與傳統(tǒng)的噬斑實(shí)驗(yàn)及TCID50結(jié)果的一致性,還具備較好的重復(fù)性。原因在于我們通過檢測NS1蛋白替代CPE的觀察,從而排除了不同操作者及實(shí)驗(yàn)室?guī)淼闹饔^差異。另外,TCID50-ELISA方法還克服了傳統(tǒng)的噬斑實(shí)驗(yàn)及TCID50-CPE方法學(xué)的缺點(diǎn),能夠同時(shí)運(yùn)用于C6/36, Vero E6, BHK-21及Vero cells等不同的敏感細(xì)胞株,且不受細(xì)胞株?duì)顟B(tài)的影響。另外,TCID50-ELISA方法亦能夠?qū)εR床分離株進(jìn)行精確的滴定;诤芎玫臏(zhǔn)確度和重復(fù)性,TCID50-ELISA可以替代傳統(tǒng)的方法對(duì)DENV進(jìn)行滴定,對(duì)登革熱的研究起到了促進(jìn)作用。 二、在本研究中,我們通過一些功能實(shí)驗(yàn)對(duì)2株抗EDⅢ交叉反應(yīng)中和抗體3E31及2D73進(jìn)行了鑒定。2株單抗均能中和DENV四個(gè)血清型的感染,且單抗與DENV結(jié)合的親和力及中和能力呈溫度依賴性。這兩株單抗在膜融合抑制實(shí)驗(yàn)及ADE實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出了不同的作用,提示二者的中和作用機(jī)制可能并不相同。本研究發(fā)現(xiàn)抗病毒中和抗體2D73能夠在病毒與細(xì)胞膜融合過程中起到增強(qiáng)作用,據(jù)我們所知,過去并未出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。這一新發(fā)現(xiàn)為后續(xù)人們對(duì)抗病毒中和抗體的功能研究提供了新思路。另外,研究發(fā)現(xiàn)中和單抗3E31不具備ADE活性,提示此抗體具備成為免疫治療性抗體的潛在可能性。 三、為了對(duì)中和單抗3E31及2D73的中和作用機(jī)制的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行研究,本研究中,我們通過結(jié)晶學(xué)技術(shù)將單抗的Fab段與EDⅢ蛋白進(jìn)行抗原抗體的共結(jié)晶。通過X-ray對(duì)晶體進(jìn)行衍射后,收集高分辨率的數(shù)據(jù)進(jìn)行三維立體晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)分析。根據(jù)最終解析的抗原抗體結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu),我們對(duì)單抗3E31和2D73所識(shí)別的抗原表位有了清晰立體的了解。隨后,我們通過模型模擬分析這2個(gè)表位分別在融合前E蛋白二聚體全長及融合后三聚體的暴露程度,以及單抗在等病毒生命周期內(nèi)的不同形態(tài)下(未成熟及成熟顆粒)的結(jié)合情況。通過以上的結(jié)構(gòu)分析,結(jié)合前期的功能研究,我們對(duì)單抗3E31和2D73的中和作用機(jī)制及ADE發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了深入的探討,彌補(bǔ)了目前人們對(duì)這兩方面理解的不足,對(duì)登革熱研究中有效疫苗的研發(fā)和評(píng)估非常關(guān)鍵。
【學(xué)位單位】:南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位年份】:2013
【中圖分類】:R373.33;R3416
【文章目錄】:
摘要
ABSTRACT
前言
    參考文獻(xiàn)
50)檢測方法滴定登革病毒'>第一部分 建立基于ELISA的半數(shù)組織感染劑量(TCID50)檢測方法滴定登革病毒
    1 材料和方法
        1.1 試劑與材料
        1.2 方法
    2 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果
        3.1 確定TCID50-ELISA方法孵育時(shí)間點(diǎn)
        3.2 TCID50-ELISA,TCID50-CPE及噬斑實(shí)驗(yàn)的定量及定性比較
    4 討論
    5 參考文獻(xiàn)
第二部分 登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)中和抗體的功能研究
    1 材料和方法
        1.1 試劑與材料
    2 結(jié)果
        2.1 抗DENV EDin單克隆抗體的制備及鑒定
        2.2 表面等離子共振技術(shù)(SPR)動(dòng)態(tài)分析登革病毒EDⅢ單克隆抗體的親和力
        2.3 單抗3E31與2D73在病毒與細(xì)胞膜融合中所起到的作用
        2.4 單抗3E31及2D73與DENV的親和力及中和活性呈溫度依賴性
        2.5 抗EDⅢ單抗的抗體依賴增強(qiáng)作用(ADE)分析
    3 討論
    4 參考文獻(xiàn)
第三部分 登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)中和抗體的結(jié)構(gòu)研究
    1 材料和方法
        1.1 主要試劑和材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果
        2.1 Fab及Fab-EDⅢ抗原抗體復(fù)合物的制備及純化
        2.2 Fab 3E31-EDⅢ及Fab 2D73-EDⅢ結(jié)晶體條件的優(yōu)化
        2.3 Fab 3E31-EDⅢ及Fab 2D73-EDⅢ結(jié)晶體特性
        2.4 單抗3E31及2D73與抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)學(xué)分析
        2.5 結(jié)構(gòu)學(xué)數(shù)據(jù)分析抗EDⅢ單抗ADE作用機(jī)制
        2.6 結(jié)構(gòu)學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合功能研究結(jié)果分析抗EDⅢ單抗的中和作用機(jī)制
    3 討論
    4 參考文獻(xiàn)
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中英文對(duì)照縮略詞表
綜述
    參考文獻(xiàn)
學(xué)習(xí)期間完成的相關(guān)論文
參加國際國內(nèi)會(huì)議
致謝
統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明

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8 徐夢(mèng)華;上海地區(qū)手足口病病原譜分析及EV71血清學(xué)流行病學(xué)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

9 王斌;流行性乙型腦炎病毒NS1蛋白單克隆抗體的制備及病毒特異性抗原表位鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2009年

10 劉志佳;肉毒毒素中和抗體的制備以及快速檢驗(yàn)診斷方法的建立和應(yīng)用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年



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