本文關(guān)鍵詞：mTOR信號(hào)通路在小鼠B淋巴細(xì)胞成熟及抗體產(chǎn)生中的作用及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景與目的雷帕霉素功能性靶蛋白(mechanistic target of rapamycin, mTOR)是一種高度保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在體內(nèi)主要形成兩種不同的復(fù)合物而行使功能,分別是mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2). mTORC1由mTOR、Raptor (regulatory-associated protein of mTOR)、mLST8/GβL (G proteinβunit-like protein)和PRAS40組成。其作為一個(gè)中心調(diào)節(jié)分子能整合細(xì)胞內(nèi)外信號(hào),從而調(diào)控細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、增殖和存活。雷帕霉素(rapamycin)可特異性抑制mTORC1的功能,并能作為一種免疫抑制劑用于臨床。結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體(TSC)是mTORC1最重要的上游調(diào)節(jié)因子,具有GTP酶活化蛋白(GTPactivating protein, GAP)活性,能使小GTP酶Rheb上的GTP分解成GDP,從而使Rheb失活。而Rheb作為mTORC1的直接上游,其活化狀態(tài)可使mTORC1激活,進(jìn)而活化其下游靶點(diǎn)磷酸化核糖體蛋白S6激酶(S6K)及轉(zhuǎn)錄起始因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1),從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯和核糖體發(fā)生。mTORC2包括mTOR、 mLST8/GPL、Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR)、mSinl (SAPK interacting protein 1)和PRR5/Protor、mSinl、Rictor和PRR5/Protor是mTORC2特有的亞單位。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞缺失Rictor將導(dǎo)致mTORC2復(fù)合物的功能喪失。關(guān)于mTORC2的功能目前知之甚少,有文獻(xiàn)表明在酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞,mTORC2可調(diào)控肌動(dòng)蛋白聚合和細(xì)胞骨架重排。mTORC2可磷酸化AKT的疏水基序(HM)(Ser473位點(diǎn)),繼而使其成為具有完全活性的激酶。AKT是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的關(guān)鍵激酶之一。越來越多的證據(jù)表明mTOR在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中起重要作用。mTOR可感受胞內(nèi)外眾多信號(hào)并整合進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境；此外,mTOR在調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞及B細(xì)胞發(fā)生及功能方面起關(guān)鍵作用。B淋巴細(xì)胞(B lymphocyte)簡(jiǎn)稱為B細(xì)胞,主要存在于血液、淋巴結(jié)、脾、扁桃體及其他黏膜組織。B細(xì)胞是體內(nèi)產(chǎn)生抗體(免疫球蛋白)的細(xì)胞,并具有抗原提呈功能,是非特異性免疫反應(yīng)及特異性體液免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要參與者。B細(xì)胞的功能與其發(fā)育程度密切相關(guān),其發(fā)育主要分為兩個(gè)階段——抗原非依賴階段和抗原依賴階段。從造血早期祖細(xì)胞發(fā)育分化為成熟B淋巴細(xì)胞,這個(gè)階段是在中樞免疫器官骨髓中進(jìn)行,它不依賴于抗原的刺激,故稱抗原非依賴階段。該階段分為早期祖B細(xì)胞(Progenitor B cell, Pro-B)、晚期Pro-B細(xì)胞、前B細(xì)胞(Precursor of B cell, Pre-B)、不成熟的B細(xì)胞(Immature B)和成熟的B細(xì)胞5個(gè)時(shí)期�？乖蕾囯A段通常發(fā)生在外周免疫器官,出現(xiàn)于B細(xì)胞對(duì)抗原產(chǎn)生應(yīng)答后。B細(xì)胞接觸抗原并分化為記憶B細(xì)胞或漿細(xì)胞。B細(xì)胞離開骨髓時(shí),功能尚未成熟,處于過渡1階段(T1)。當(dāng)隨著血流進(jìn)入脾臟時(shí),B細(xì)胞逐步發(fā)育為過渡2階段(T2)、成熟(Mature B)和邊緣區(qū)B細(xì)胞(marginal zone B cell, MZB)。T2 B細(xì)胞在脾臟和淋巴結(jié)的濾泡中分化為成熟的濾泡B細(xì)胞(follicular B cell,FOB),在脾臟中分化為邊緣區(qū)B細(xì)胞。B細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖受阻,或漿細(xì)胞功能異常將會(huì)導(dǎo)致抗體合成或分泌缺陷,在臨床上稱為原發(fā)性體液免疫缺陷病。在不同類型的抗體缺陷疾病中,主要的異常存在于B細(xì)胞成熟的不同階段或成熟B細(xì)胞對(duì)抗原刺激的應(yīng)答過程中。這類疾病的臨床典型特征是反復(fù)的化膿性細(xì)菌感染,若不積極治療患者多于成年前死亡。也有大量文獻(xiàn)報(bào)道B細(xì)胞與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎@A)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、橋本甲狀腺炎、Graves病、強(qiáng)直性脊柱炎、重癥肌無力、胰島素依賴性糖尿病(DM)及RF陰性的青少年關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病密切相關(guān)。mTOR作為一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)分子,對(duì)于機(jī)體的體液免疫及生發(fā)中心形成起著關(guān)鍵作用。已有文獻(xiàn)證實(shí)mTOR參與小鼠體液免疫反應(yīng),脾臟的生發(fā)中心形成、抗體親和力成熟、體細(xì)胞超突變(SHM)及免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換(CSR)等多個(gè)方面。有文獻(xiàn)表明mTORC1上游的抑癌基因pten參與了B1群、邊緣帶B細(xì)胞群(MZB)的分化及B細(xì)胞體外增殖和存活。同樣,在另外的研究中也發(fā)現(xiàn),mTORC1上游抑制基因tsc1參與了B細(xì)胞成熟及邊緣帶B細(xì)胞(MZB)的發(fā)生。在關(guān)于mTORC2的研究中,研究者發(fā)現(xiàn)sin1敲除的祖B細(xì)胞向IgM+的不成熟B細(xì)胞分化減少,其il-7r及rag重組酶(rag1和rag2)基因表達(dá)水平升高,從而導(dǎo)致祖B細(xì)胞V(D)J重排活性增加。由于mTORC2調(diào)控AKT的磷酸化,從而推斷AKT是mTORC2調(diào)節(jié)RAG表達(dá)過程的主要調(diào)控點(diǎn)。小鼠祖B細(xì)胞敲除Akt2與敲除sin1出現(xiàn)相似的RAG表達(dá)升高。小鼠B細(xì)胞敲除Akt2的研究證實(shí)AKT對(duì)于MZB及B1細(xì)胞群的發(fā)生及促進(jìn)FOB的存活也起著重要作用。因此,mTORC2可能調(diào)節(jié)成熟B細(xì)胞的存活、增殖,并且對(duì)于邊緣帶B細(xì)胞和B1細(xì)胞的發(fā)育十分重要。目前尚無研究表明mTORC1及mTORC2的核心蛋白R(shí)aptor與Rictor分別對(duì)B淋巴細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和功能起何種作用�；诖�,我們利用Cre-loxp系統(tǒng)建立了小鼠B淋巴細(xì)胞分別特異性敲除raptor和rictor的動(dòng)物模型(CD19-Cre; raptor-loxp; rictor-loxp)并開展了相關(guān)研究。二、研究方法1、應(yīng)用Cre-loxp系統(tǒng),我們分別成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞敲除raptor和敲除rictor的小鼠模型。應(yīng)用PCR和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行小鼠基因型的鑒定,用western blot技術(shù)確定敲除效果。2、通過流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠骨髓及脾臟等淋巴組織,檢測(cè)rictor缺失對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞發(fā)育的影響。3、分別通過ELISA檢測(cè)分析敲除raptor和敲除rictor對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞體液免疫功能的影響。4、通過流式細(xì)胞術(shù)分析rictor缺失對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞凋亡的影響。5、通過qPCR技術(shù)分析敲除rictor對(duì)B淋巴細(xì)胞bcl-2、rag2及il-7r基因表達(dá)的影響。三、研究結(jié)果1、成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞特異性敲除raptor小鼠模型利用Cre-loxp系統(tǒng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞特異性raptor敲除小鼠(B cell-raptor KO)。經(jīng)PCR檢測(cè)基因型及western blot檢測(cè)B淋巴細(xì)胞中Raptor及其下游pS6的蛋白表達(dá)水平已證實(shí)敲除小鼠的B淋巴細(xì)胞的確缺乏Raptor蛋白的表達(dá),且其mTORC1的活性下降。2、B淋巴細(xì)胞特異性敲除raptor影響體液免疫功能我們初步檢測(cè)了B淋巴細(xì)胞特異性敲除raptor的小鼠的B細(xì)胞功能。利用經(jīng)典的胸腺依賴性抗原OVA免疫小鼠的方法得到產(chǎn)生特異性抗體的小鼠,通過ELISA檢測(cè)特異性抗體的水平,發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞敲除raptor導(dǎo)致OVA-IgG、OVA-IgM的水平下降。3、成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞特異性敲除rictor小鼠模型利用Cre-loxp系統(tǒng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞特異性rictor敲除小鼠。經(jīng)PCR檢測(cè)基因型及western blot檢測(cè)B淋巴細(xì)胞中Rictor的蛋白表達(dá)水平已證實(shí)敲除效果,且其mTORC2的活性下降。4、B淋巴細(xì)胞特異性敲除rictor影響B(tài)細(xì)胞成熟,導(dǎo)致骨髓B細(xì)胞rag2和il-7r的mRNA表達(dá)水平增加采用流式細(xì)胞學(xué)的方法分析了小鼠體內(nèi)B細(xì)胞亞群,結(jié)果顯示：①骨髓中B細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照相比無差異,但進(jìn)一步分析骨髓中各階段B淋巴細(xì)胞顯示：Pre B cells明顯升高,而ImmatureB細(xì)胞顯著減少。提示B淋巴細(xì)胞在發(fā)育過程中可能部分阻斷在Pre B cells階段而無法向一下階段分化并進(jìn)一步成熟。采用qPCR的方法分析了小鼠骨髓B淋巴細(xì)胞中rag2及il-7r的mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)較對(duì)照野生型相比,敲除鼠的rag2及il-7r的mRNA表達(dá)上調(diào),這可能是B細(xì)胞發(fā)育中阻斷在Pre-B階段的原因。②敲除小鼠的脾臟中B細(xì)胞明顯減少,進(jìn)一步分析脾臟中各個(gè)B細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn),Transitional B、Follicular B cells及Marginal zone各群的比例在敲除組及對(duì)照組中無明顯差異。提示Rictor敲除導(dǎo)致脾臟中成熟B細(xì)胞減少,但不影響外周淋巴組織的B細(xì)胞亞群分布。③同時(shí),我們還檢測(cè)了主要分布在腹腔的B1細(xì)胞群,結(jié)果顯示B細(xì)胞敲除Rictor導(dǎo)致B1細(xì)胞減少。5、B細(xì)胞敲除rictor導(dǎo)致B細(xì)胞凋亡增多、Bcl-2表達(dá)水平下降我們采用了AnnexinV標(biāo)記脾臟B細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV陽(yáng)性細(xì)胞率,結(jié)果顯示敲除小鼠的脾臟B細(xì)胞較對(duì)照小鼠凋亡增加。并且為了探討敲除rictor引起B(yǎng)細(xì)胞凋亡增加的分子機(jī)制,我們提取敲除小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的RNA,利用qPCR技術(shù)分析了bcl2家族的經(jīng)典抗凋亡基因bcl-2的mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)敲除小鼠B細(xì)胞bcl-2表達(dá)水平較對(duì)照野生型小鼠相比明顯下降。6、B淋巴細(xì)胞特異性敲除rictor影響體液免疫功能我們檢測(cè)了B淋巴細(xì)胞特異性敲除rictor的小鼠的B細(xì)胞功能。利用OVA免疫小鼠的方法得到產(chǎn)生特異性抗體的小鼠,通過ELISA檢測(cè)特異性抗體的水平,我們發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞敲除rictor導(dǎo)致OVA-IgM及OVA-IgG的水平較對(duì)照野生型小鼠相比明顯減少。四、結(jié)論1、成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細(xì)胞特異性敲除mTORC1的主要組分raptor和mTORC2的主要組分rictor的小鼠模型,經(jīng)PCR及Western blot驗(yàn)證了敲除效果。2、mTOR信號(hào)通路影響小鼠B淋巴細(xì)胞成熟。我們發(fā)現(xiàn)敲除rictor的小鼠骨髓中Pre B細(xì)胞群增多,外周成熟B細(xì)胞減少,骨髓B細(xì)胞中rag2和il-7r的mRNA表達(dá)水平增加。3、敲除rictor促進(jìn)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞凋亡。4、mTOR信號(hào)通路影響小鼠B淋巴細(xì)胞體液免疫應(yīng)答。敲除raptor及敲除rictor的小鼠都出現(xiàn)對(duì)OVA免疫產(chǎn)生的特異性抗體水平(OVA-IgM、OVA-IgG)下降。
【關(guān)鍵詞】：mTOR Raptor Rictor B淋巴細(xì)胞成熟 抗體生成 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 1. 前言18-31
• 1.1 B淋巴細(xì)胞18-21
• 1.1.1 抗原非依賴期18-20
• 1.1.2 抗原依賴期20-21
• 1.1.3 B1細(xì)胞21
• 1.2 B淋巴細(xì)胞與疾病21-23
• 1.2.1 先天性B細(xì)胞缺陷21-22
• 1.2.2 自身免疫性疾病22-23
• 1.2.3 慢性B淋巴細(xì)胞白血病23
• 1.3 MTOR信號(hào)通路23-26
• 1.4 B淋巴細(xì)胞與MTDR26-27
• 1.5 基因敲除與CRE-LOXP系統(tǒng)27-31
• 1.5.1 cre重組酶28
• 1.5.2 loxp(locus of X-over P1)序列28
• 1.5.3 cre-loxp系統(tǒng)的特性28-29
• 1.5.4 cre-loxp系統(tǒng)在基因打靶中的應(yīng)用29-31
• 2. 材料與方法31-46
• 3. 結(jié)果46-67
• 3.1 構(gòu)建B淋巴細(xì)胞特異性敲除raptor小鼠(B cell-raptor KO)46-48
• 3.2 B淋巴細(xì)胞特異性敲除raptor影響B(tài)細(xì)胞體液免疫功能48-50
• 3.3 構(gòu)建B淋巴細(xì)胞特異性敲除rictor小鼠(B cell-rictor KO)50-52
• 3.4 B淋巴細(xì)胞特異性敲除rictor影響骨髓B細(xì)胞分化52-57
• 3.5 B淋巴細(xì)胞特異性敲除rictor影響脾臟B細(xì)胞成熟,但不影響其亞群分布57-60
• 3.6 敲除rictor導(dǎo)致脾臟B細(xì)胞凋亡增加60-62
• 3.7 B淋巴細(xì)胞特異性敲除rictor導(dǎo)致B1細(xì)胞減少62-64
• 3.8 B淋巴細(xì)胞特異性敲除rictor影響B(tài)細(xì)胞體液免疫功能64-67
• 4. 討論67-70
• 5. 結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-76
• 附錄 中英文縮略詞對(duì)照表76-78
• 碩士研究生期間發(fā)表論文情況78-79
• 致謝79-80

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 韓瑩;史道華;;中藥抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的新途徑—mTOR[J];海峽藥學(xué);2005年06期

2 鄒金凱;車寧;孫春華;;mTOR功能及其抑制劑研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2008年10期

3 陳莉君;史道華;;mTOR結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2012年11期

4 陳j,張紅鋒;mTOR信號(hào)通路與癌癥治療[J];生命的化學(xué);2005年02期

5 朱倫;陳增良;;mTOR的結(jié)構(gòu)與功能[J];國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志;2006年01期

6 ;Expression of mTOR/P70 S6K in oral acinic cell carcinoma[J];Journal of Microbiology and Immunology;2007年01期

7 李剛;閆若東;穆中一;黃炎;胡濱;;mTOR對(duì)非激素依賴性前列腺癌的作用研究[J];腫瘤學(xué)雜志;2013年12期

8 韓瑩;史道華;;雷帕霉素作用與mTOR結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究進(jìn)展[J];解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào);2006年04期

9 劉旭;張東亮;劉文虎;;mTOR抑制劑治療常染色體顯性多囊腎病的研究進(jìn)展[J];中國(guó)全科醫(yī)學(xué);2010年20期

10 張超;章雄文;丁健;;Akt-mTOR的互動(dòng)與癌癥的發(fā)生[J];生命科學(xué);2007年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 Huayong Zhou;Yi Wang;Lanping Ma;Xin Wang;Lin Chen;Yi Chen;Jian Ding;Tao Meng;Linhua Meng;Jingkang Shen;;Novel indazole-based derivatives as PI3K/mTOR dual inhibitors[A];2012長(zhǎng)三角藥物化學(xué)研討會(huì)論文集[C];2012年

2 ;Activation of mTOR Pathway Confers Adverse Outcome in Nonsmall Cell Lung Carcinoma[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)胸部腫瘤及內(nèi)窺鏡學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

3 韓進(jìn)松;陳穎;宋云龍;呂加國(guó);周有駿;朱駒;;Structure-Based Design,Synthesis,and Antitumor Activities of Novel Water-soluble Dual Inhibitors of PI3K and mTOR[A];2012長(zhǎng)三角藥物化學(xué)研討會(huì)論文集[C];2012年

4 姜偉;王修啟;束剛;江青艷;楊舟;;mTOR信號(hào)通路及其對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成的影響[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

5 管坤良;;The TSC-mTOR pathway in cell growth and cancer[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

6 Hai Huang;Xin Liu;;The molecular mechanism of apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells induced by evodiamine inhibition mTOR signal pathway[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議摘要集[C];2010年

7 孟祥斐;郁金泰;譚蘭;;靶向作用于mTOR治療癲癇[A];山東省2013年神經(jīng)內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)神經(jīng)免疫大會(huì)2013論文匯編[C];2013年

8 曾軍英;胡興;皮建輝;;Cytotoxic Elimination of Chemoresistant Pancreatic Cancer Stem Cells by Combined Inhibition of RON and mTOR Signaling Pathways[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2013年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2013年

9 ;mTOR enhancement of STIM1-mediated store-operated Ca~(2+) signaling constrains tumor development[A];第九屆全國(guó)鈣信號(hào)和細(xì)胞功能研討會(huì)論文摘要集[C];2012年

10 ;mTOR.rictor Is Required by the Development of Mouse One-cell Stage Embryos[A];第九屆全國(guó)酶學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)暨鄒承魯誕辰85周年紀(jì)念會(huì)論文摘要集[C];2008年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 駐京記者 李瑤;mTOR提供癌癥治療新思路[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2010年

2 本報(bào)記者 白毅;mTOR信號(hào)通路為腫瘤治療提供新靶點(diǎn)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2010年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉倫志;腎素抑制劑對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡與mTOR表達(dá)的影響[D];武漢大學(xué);2014年

2 李舒展;PGAM1在mTOR誘導(dǎo)腫瘤有氧糖酵解中的作用及機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

3 叢江琳;MiR-634通過調(diào)控mTOR信號(hào)途徑抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2015年

4 苗麗君;慢病毒介導(dǎo)的mTOR靶向抑制對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生物學(xué)功能的影響[D];鄭州大學(xué);2012年

5 曾梅;自我吞噬及mTOR信號(hào)在小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞分化過程中的作用[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2008年

6 周樂杜;PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制中的作用及靶向干預(yù)研究[D];中南大學(xué);2010年

7 張慧;蛋白攝入水平對(duì)早產(chǎn)學(xué)習(xí)認(rèn)知能力及mTOR/S6K通路的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

8 劉U，

本文編號(hào)：283227