發(fā)布時間：2017-04-02 22:09

  本文關鍵詞：mTOR信號通路在小鼠B淋巴細胞成熟及抗體產(chǎn)生中的作用及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景與目的雷帕霉素功能性靶蛋白(mechanistic target of rapamycin, mTOR)是一種高度保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在體內主要形成兩種不同的復合物而行使功能,分別是mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2). mTORC1由mTOR、Raptor (regulatory-associated protein of mTOR)、mLST8/GβL (G proteinβunit-like protein)和PRAS40組成。其作為一個中心調節(jié)分子能整合細胞內外信號,從而調控細胞代謝、生長、增殖和存活。雷帕霉素(rapamycin)可特異性抑制mTORC1的功能,并能作為一種免疫抑制劑用于臨床。結節(jié)性硬化癥復合體(TSC)是mTORC1最重要的上游調節(jié)因子,具有GTP酶活化蛋白(GTPactivating protein, GAP)活性,能使小GTP酶Rheb上的GTP分解成GDP,從而使Rheb失活。而Rheb作為mTORC1的直接上游,其活化狀態(tài)可使mTORC1激活,進而活化其下游靶點磷酸化核糖體蛋白S6激酶(S6K)及轉錄起始因子4E結合蛋白1(4E-BP1),從而促進細胞內蛋白翻譯和核糖體發(fā)生。mTORC2包括mTOR、 mLST8/GPL、Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR)、mSinl (SAPK interacting protein 1)和PRR5/Protor、mSinl、Rictor和PRR5/Protor是mTORC2特有的亞單位。在哺乳動物細胞缺失Rictor將導致mTORC2復合物的功能喪失。關于mTORC2的功能目前知之甚少,有文獻表明在酵母及哺乳動物細胞,mTORC2可調控肌動蛋白聚合和細胞骨架重排。mTORC2可磷酸化AKT的疏水基序(HM)(Ser473位點),繼而使其成為具有完全活性的激酶。AKT是調節(jié)細胞存活的關鍵激酶之一。越來越多的證據(jù)表明mTOR在免疫反應調節(jié)過程中起重要作用。mTOR可感受胞內外眾多信號并整合進而調節(jié)免疫微環(huán)境；此外,mTOR在調節(jié)中性粒細胞、肥大細胞、樹突狀細胞、T細胞及B細胞發(fā)生及功能方面起關鍵作用。B淋巴細胞(B lymphocyte)簡稱為B細胞,主要存在于血液、淋巴結、脾、扁桃體及其他黏膜組織。B細胞是體內產(chǎn)生抗體(免疫球蛋白)的細胞,并具有抗原提呈功能,是非特異性免疫反應及特異性體液免疫應答反應的主要參與者。B細胞的功能與其發(fā)育程度密切相關,其發(fā)育主要分為兩個階段——抗原非依賴階段和抗原依賴階段。從造血早期祖細胞發(fā)育分化為成熟B淋巴細胞,這個階段是在中樞免疫器官骨髓中進行,它不依賴于抗原的刺激,故稱抗原非依賴階段。該階段分為早期祖B細胞(Progenitor B cell, Pro-B)、晚期Pro-B細胞、前B細胞(Precursor of B cell, Pre-B)、不成熟的B細胞(Immature B)和成熟的B細胞5個時期。抗原依賴階段通常發(fā)生在外周免疫器官,出現(xiàn)于B細胞對抗原產(chǎn)生應答后。B細胞接觸抗原并分化為記憶B細胞或漿細胞。B細胞離開骨髓時,功能尚未成熟,處于過渡1階段(T1)。當隨著血流進入脾臟時,B細胞逐步發(fā)育為過渡2階段(T2)、成熟(Mature B)和邊緣區(qū)B細胞(marginal zone B cell, MZB)。T2 B細胞在脾臟和淋巴結的濾泡中分化為成熟的濾泡B細胞(follicular B cell,FOB),在脾臟中分化為邊緣區(qū)B細胞。B細胞發(fā)育、分化、增殖受阻,或漿細胞功能異常將會導致抗體合成或分泌缺陷,在臨床上稱為原發(fā)性體液免疫缺陷病。在不同類型的抗體缺陷疾病中,主要的異常存在于B細胞成熟的不同階段或成熟B細胞對抗原刺激的應答過程中。這類疾病的臨床典型特征是反復的化膿性細菌感染,若不積極治療患者多于成年前死亡。也有大量文獻報道B細胞與類風濕性關節(jié)炎@A)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、橋本甲狀腺炎、Graves病、強直性脊柱炎、重癥肌無力、胰島素依賴性糖尿病(DM)及RF陰性的青少年關節(jié)炎等多種自身免疫性疾病密切相關。mTOR作為一個重要的免疫調節(jié)分子,對于機體的體液免疫及生發(fā)中心形成起著關鍵作用。已有文獻證實mTOR參與小鼠體液免疫反應,脾臟的生發(fā)中心形成、抗體親和力成熟、體細胞超突變(SHM)及免疫球蛋白類型轉換(CSR)等多個方面。有文獻表明mTORC1上游的抑癌基因pten參與了B1群、邊緣帶B細胞群(MZB)的分化及B細胞體外增殖和存活。同樣,在另外的研究中也發(fā)現(xiàn),mTORC1上游抑制基因tsc1參與了B細胞成熟及邊緣帶B細胞(MZB)的發(fā)生。在關于mTORC2的研究中,研究者發(fā)現(xiàn)sin1敲除的祖B細胞向IgM+的不成熟B細胞分化減少,其il-7r及rag重組酶(rag1和rag2)基因表達水平升高,從而導致祖B細胞V(D)J重排活性增加。由于mTORC2調控AKT的磷酸化,從而推斷AKT是mTORC2調節(jié)RAG表達過程的主要調控點。小鼠祖B細胞敲除Akt2與敲除sin1出現(xiàn)相似的RAG表達升高。小鼠B細胞敲除Akt2的研究證實AKT對于MZB及B1細胞群的發(fā)生及促進FOB的存活也起著重要作用。因此,mTORC2可能調節(jié)成熟B細胞的存活、增殖,并且對于邊緣帶B細胞和B1細胞的發(fā)育十分重要。目前尚無研究表明mTORC1及mTORC2的核心蛋白Raptor與Rictor分別對B淋巴細胞的穩(wěn)態(tài)和功能起何種作用。基于此,我們利用Cre-loxp系統(tǒng)建立了小鼠B淋巴細胞分別特異性敲除raptor和rictor的動物模型(CD19-Cre; raptor-loxp; rictor-loxp)并開展了相關研究。二、研究方法1、應用Cre-loxp系統(tǒng),我們分別成功構建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞敲除raptor和敲除rictor的小鼠模型。應用PCR和瓊脂糖凝膠電泳進行小鼠基因型的鑒定,用western blot技術確定敲除效果。2、通過流式細胞術分析小鼠骨髓及脾臟等淋巴組織,檢測rictor缺失對小鼠B淋巴細胞發(fā)育的影響。3、分別通過ELISA檢測分析敲除raptor和敲除rictor對小鼠B淋巴細胞體液免疫功能的影響。4、通過流式細胞術分析rictor缺失對小鼠B淋巴細胞凋亡的影響。5、通過qPCR技術分析敲除rictor對B淋巴細胞bcl-2、rag2及il-7r基因表達的影響。三、研究結果1、成功構建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞特異性敲除raptor小鼠模型利用Cre-loxp系統(tǒng)成功構建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞特異性raptor敲除小鼠(B cell-raptor KO)。經(jīng)PCR檢測基因型及western blot檢測B淋巴細胞中Raptor及其下游pS6的蛋白表達水平已證實敲除小鼠的B淋巴細胞的確缺乏Raptor蛋白的表達,且其mTORC1的活性下降。2、B淋巴細胞特異性敲除raptor影響體液免疫功能我們初步檢測了B淋巴細胞特異性敲除raptor的小鼠的B細胞功能。利用經(jīng)典的胸腺依賴性抗原OVA免疫小鼠的方法得到產(chǎn)生特異性抗體的小鼠,通過ELISA檢測特異性抗體的水平,發(fā)現(xiàn)B細胞敲除raptor導致OVA-IgG、OVA-IgM的水平下降。3、成功構建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞特異性敲除rictor小鼠模型利用Cre-loxp系統(tǒng)成功構建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞特異性rictor敲除小鼠。經(jīng)PCR檢測基因型及western blot檢測B淋巴細胞中Rictor的蛋白表達水平已證實敲除效果,且其mTORC2的活性下降。4、B淋巴細胞特異性敲除rictor影響B(tài)細胞成熟,導致骨髓B細胞rag2和il-7r的mRNA表達水平增加采用流式細胞學的方法分析了小鼠體內B細胞亞群,結果顯示：①骨髓中B細胞數(shù)量與對照相比無差異,但進一步分析骨髓中各階段B淋巴細胞顯示：Pre B cells明顯升高,而ImmatureB細胞顯著減少。提示B淋巴細胞在發(fā)育過程中可能部分阻斷在Pre B cells階段而無法向一下階段分化并進一步成熟。采用qPCR的方法分析了小鼠骨髓B淋巴細胞中rag2及il-7r的mRNA表達水平,發(fā)現(xiàn)較對照野生型相比,敲除鼠的rag2及il-7r的mRNA表達上調,這可能是B細胞發(fā)育中阻斷在Pre-B階段的原因。②敲除小鼠的脾臟中B細胞明顯減少,進一步分析脾臟中各個B細胞亞群發(fā)現(xiàn),Transitional B、Follicular B cells及Marginal zone各群的比例在敲除組及對照組中無明顯差異。提示Rictor敲除導致脾臟中成熟B細胞減少,但不影響外周淋巴組織的B細胞亞群分布。③同時,我們還檢測了主要分布在腹腔的B1細胞群,結果顯示B細胞敲除Rictor導致B1細胞減少。5、B細胞敲除rictor導致B細胞凋亡增多、Bcl-2表達水平下降我們采用了AnnexinV標記脾臟B細胞,通過流式細胞儀檢測AnnexinV陽性細胞率,結果顯示敲除小鼠的脾臟B細胞較對照小鼠凋亡增加。并且為了探討敲除rictor引起B(yǎng)細胞凋亡增加的分子機制,我們提取敲除小鼠脾臟B淋巴細胞的RNA,利用qPCR技術分析了bcl2家族的經(jīng)典抗凋亡基因bcl-2的mRNA表達水平,發(fā)現(xiàn)敲除小鼠B細胞bcl-2表達水平較對照野生型小鼠相比明顯下降。6、B淋巴細胞特異性敲除rictor影響體液免疫功能我們檢測了B淋巴細胞特異性敲除rictor的小鼠的B細胞功能。利用OVA免疫小鼠的方法得到產(chǎn)生特異性抗體的小鼠,通過ELISA檢測特異性抗體的水平,我們發(fā)現(xiàn)B細胞敲除rictor導致OVA-IgM及OVA-IgG的水平較對照野生型小鼠相比明顯減少。四、結論1、成功構建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞特異性敲除mTORC1的主要組分raptor和mTORC2的主要組分rictor的小鼠模型,經(jīng)PCR及Western blot驗證了敲除效果。2、mTOR信號通路影響小鼠B淋巴細胞成熟。我們發(fā)現(xiàn)敲除rictor的小鼠骨髓中Pre B細胞群增多,外周成熟B細胞減少,骨髓B細胞中rag2和il-7r的mRNA表達水平增加。3、敲除rictor促進小鼠脾臟B淋巴細胞凋亡。4、mTOR信號通路影響小鼠B淋巴細胞體液免疫應答。敲除raptor及敲除rictor的小鼠都出現(xiàn)對OVA免疫產(chǎn)生的特異性抗體水平(OVA-IgM、OVA-IgG)下降。
【關鍵詞】：mTOR Raptor Rictor B淋巴細胞成熟 抗體生成 凋亡
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 1. 前言18-31
• 1.1 B淋巴細胞18-21
• 1.1.1 抗原非依賴期18-20
• 1.1.2 抗原依賴期20-21
• 1.1.3 B1細胞21
• 1.2 B淋巴細胞與疾病21-23
• 1.2.1 先天性B細胞缺陷21-22
• 1.2.2 自身免疫性疾病22-23
• 1.2.3 慢性B淋巴細胞白血病23
• 1.3 MTOR信號通路23-26
• 1.4 B淋巴細胞與MTDR26-27
• 1.5 基因敲除與CRE-LOXP系統(tǒng)27-31
• 1.5.1 cre重組酶28
• 1.5.2 loxp(locus of X-over P1)序列28
• 1.5.3 cre-loxp系統(tǒng)的特性28-29
• 1.5.4 cre-loxp系統(tǒng)在基因打靶中的應用29-31
• 2. 材料與方法31-46
• 3. 結果46-67
• 3.1 構建B淋巴細胞特異性敲除raptor小鼠(B cell-raptor KO)46-48
• 3.2 B淋巴細胞特異性敲除raptor影響B(tài)細胞體液免疫功能48-50
• 3.3 構建B淋巴細胞特異性敲除rictor小鼠(B cell-rictor KO)50-52
• 3.4 B淋巴細胞特異性敲除rictor影響骨髓B細胞分化52-57
• 3.5 B淋巴細胞特異性敲除rictor影響脾臟B細胞成熟,但不影響其亞群分布57-60
• 3.6 敲除rictor導致脾臟B細胞凋亡增加60-62
• 3.7 B淋巴細胞特異性敲除rictor導致B1細胞減少62-64
• 3.8 B淋巴細胞特異性敲除rictor影響B(tài)細胞體液免疫功能64-67
• 4. 討論67-70
• 5. 結論70-71
• 參考文獻71-76
• 附錄 中英文縮略詞對照表76-78
• 碩士研究生期間發(fā)表論文情況78-79
• 致謝79-80

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本文編號：283227