發(fā)布時(shí)間：2017-03-29 22:11

  本文關(guān)鍵詞：人ATP2A3基因慢病毒shRNA載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的構(gòu)建人ATP2A3基因慢病毒shRNA載體并進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步探討鹽霉素通過調(diào)控ATP2A3基因抗腫瘤干細(xì)胞的機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)材料。 方法1.構(gòu)建4條ATP2A3基因慢病毒shRNA載體：將目的基因干擾序列連接到pGMLV-SC1RNA干擾慢病毒載體后將其轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞中，等生成單克隆菌落后行PCR測序鑒定，測序比對正確的克隆即為所需的ATP2A3基因RNAi慢病毒載體。2.包裝慢病毒及測定病毒滴度：抽提高純度、無內(nèi)毒素的慢病毒shRNA載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，使用HG transgene reagent將兩者共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，通過促轉(zhuǎn)染、換液、培養(yǎng)等處理后，獲取細(xì)胞上清液，進(jìn)一步經(jīng)濃縮后獲得高滴度慢病毒濃縮液，，在293T細(xì)胞中標(biāo)定其病毒滴度。3.干擾載體對PC-3細(xì)胞內(nèi)ATP2A3的沉默評(píng)價(jià)：用包裝好的慢病毒以及慢病毒陰性對照感染靶細(xì)胞PC-3，感染成功后通過Western Blot和RT-PCR方法評(píng)價(jià)干擾載體對靶基因的干擾效果。 結(jié)果1.對構(gòu)建好的4條慢病毒干擾載體經(jīng)PCR測序鑒定，DNA序列均無位點(diǎn)突變，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.將構(gòu)建好的慢病毒載體質(zhì)粒陽性克隆菌株轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后熒光顯微鏡下可見綠色熒光；在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，最終純化出pGMLV-SC1-ATP2A3慢病毒顆粒，并測得其滴度為1*109TU/ml。3.病毒感染靶細(xì)胞后，經(jīng)Western blot及RT-PCR驗(yàn)證，4條shRNA均有一定的沉默，其中以ATP2A3-shRNA4最明顯。 結(jié)論1.通過RNA干擾技術(shù)，成功構(gòu)建了人ATP2A3基因慢病毒shRNA載體。2.構(gòu)建的干擾載體能夠順利的進(jìn)行慢病毒的包裝，并獲得較高的病毒滴度。3.RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果表明，ATP2A3-shRNA4為ATP2A3四個(gè)靶點(diǎn)中沉默效果最佳者，由其感染的PC-3細(xì)胞株為探討鹽霉素通過調(diào)控ATP2A3抗腫瘤干細(xì)胞機(jī)理研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。
【關(guān)鍵詞】：ATP2A3 RNA干擾 慢病毒 質(zhì)粒構(gòu)建 鹽霉素
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 第一章 前言8-10
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料10-12
• 第三章 實(shí)驗(yàn)方法12-21
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-29
• 第五章 討論29-34
• 第六章 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-39
• 主要縮略英文索引39-41
• 文獻(xiàn)綜述41-50
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 碩士期間發(fā)表的論文50-51
• 致謝51-52

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張薇;趙志英;張坤;;慢病毒載體及應(yīng)用研究進(jìn)展[J];包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年05期

  本文關(guān)鍵詞：人ATP2A3基因慢病毒shRNA載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：275527