本文關(guān)鍵詞：Notch信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)特征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：細(xì)胞分化就是由一種相同的細(xì)胞類型經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂后逐漸在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上形成穩(wěn)定性差異,產(chǎn)生不同的細(xì)胞類群的過(guò)程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells BMSCs)為中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞,具有多向分化潛能,可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞甚至神經(jīng)細(xì)胞等成熟細(xì)胞。人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下能夠分化成具有功能的肝細(xì)胞。還有證據(jù)表明卵圓細(xì)胞也有可能來(lái)自于BMSCs進(jìn)一步分化成肝細(xì)胞。此外,已有一整套特殊的誘導(dǎo)機(jī)制保證了BMSCs能轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。BMSCs可以成功分化為肝細(xì)胞,但是控制這一過(guò)程的確切機(jī)制還不清楚。隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能不斷被研究,其正被逐漸用于臨床某些疾病的治療過(guò)程中。Notch家族是由一組高度保守的蛋白質(zhì)組成,在哺乳動(dòng)物中Notch家族有四個(gè)Notch受體(Notch1-4)和五個(gè)配體,即兩個(gè)Serrate樣基因(Jagged1-2)和三個(gè)Delta樣基因(Dll1,3和4)當(dāng)配體與受體結(jié)合后Notch受體的胞內(nèi)形式在細(xì)胞表面釋放的Presenilin(PS)/γ-水解酶的作用下水解裂變。釋放出其活化形式(NICD)與CSL DNA結(jié)合蛋白(CBF1, Su(H), Lag-2)結(jié)合,將CBF1一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄活化因子。Notch信號(hào)通路對(duì)器官發(fā)育至關(guān)重要,Notch信號(hào)通路與細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有著密切相關(guān)的牽連,Notch信號(hào)可由相鄰細(xì)胞之間配 體受體作用引發(fā),進(jìn)而引起蛋白酶剪切反應(yīng)。研究表明,Notch蛋白的表達(dá)可以抑制細(xì)胞向特定的方向分化,典型的例子是Notch通路對(duì)周圍神經(jīng)分化的調(diào)節(jié)。同時(shí)也有研究報(bào)道稱激活Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Notch信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)特征卻很少見(jiàn)有報(bào)道,本課題首先分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,然后用制備的誘導(dǎo)液對(duì)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,以研究Notch信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過(guò)程中的作用,探討其可能的分子機(jī)制,為體外獲得大量的肝細(xì)胞尋找理想的途徑,對(duì)細(xì)胞移植有重要的意義。 目的：探尋Notch信號(hào)通路對(duì)BMSCs向肝細(xì)胞分化過(guò)程中的分子影響機(jī)制,為臨床上肝細(xì)胞移植提供基礎(chǔ)性研究。 方法： 1.肝損動(dòng)物模型的構(gòu)建：通過(guò)0.25%2-乙酰氨基芴(2-AAF)溶液灌胃及腹腔注射四氯化碳,成功構(gòu)建了肝損動(dòng)物模型,以便后繼實(shí)驗(yàn)使用。 2.肝組織萃取物(誘導(dǎo)液)的制備：將用四氯化碳(CC14)和2-乙酰氨基芴(2-AFF)制造的肝損傷動(dòng)物模型的肝萃取物作為BMSCs誘導(dǎo)分化的刺激因子。將BMSCs植入含有肝損傷動(dòng)物模型肝萃取物的(DMEM-F12)這一混合培養(yǎng)基中。對(duì)照組的培養(yǎng)基里用正常的動(dòng)物肝萃取物取代實(shí)驗(yàn)組的肝損的肝萃取物。分別提取第Od,7d,11d,21d的兩組BMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的獲取及鑒定：將實(shí)驗(yàn)所需的SD大鼠用乙醚窒息法處死。再將SD大鼠脛骨骨髓腔中的骨髓收集在培養(yǎng)基中,取第四代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記表明成功獲得骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。 4.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及分化狀態(tài)的鑒定：用獲得的大鼠肝臟組織萃取物對(duì)第四代培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),每三天換液一次,培養(yǎng)21天,選擇若干細(xì)胞表面標(biāo)記對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR鑒定：M2-PK,GST-P, Albumin,Bst-1,用于表明已經(jīng)成功誘導(dǎo)了骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化。 5.將BMSCs加入Jaggedl進(jìn)行共培養(yǎng),Jaggedl是一種可溶性的蛋白,按照濃度為10ng/ml的比例加入到含有肝損傷萃取物的DMEM培養(yǎng)基中。 6.BMSCs與Jagged1共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Notch的下游基因Hesl及Heyl的表達(dá)量明顯上調(diào),BMSCs與DAPT共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Notch的下游基因Hesl及Heyl的表達(dá)量明顯下調(diào)。Notch信號(hào)通路可能起對(duì)BMSCs肝向分化的抑制作用。單獨(dú)用DAPT或Jagged1與DAPT聯(lián)合作用于BMSCs均不顯示對(duì)BMSC的分化有影響。 結(jié)果： 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了肝損大鼠動(dòng)物模型,且分離了可以用于誘導(dǎo)分化的誘導(dǎo)液。本實(shí)驗(yàn)所需的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)至第4代后。利用Hoechst33342染色驗(yàn)證其純度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)底部附著細(xì)胞都成呈陽(yáng)性的染色,Hoechst33342陽(yáng)性結(jié)果證明所分離的細(xì)胞符合BMSCs的細(xì)胞特性。經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞測(cè)試第四代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的CD29和CD44高陽(yáng)性率,CD34和CD45幾乎不表達(dá)。符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn),不是造血類的干細(xì)胞,而且其細(xì)胞特性穩(wěn)定。在誘導(dǎo)因素作用的倒置相差顯微鏡鏡下,少數(shù)貼壁不好的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,而幸存的細(xì)胞則繼續(xù)增殖分化。在經(jīng)誘導(dǎo)后的第7d和第11d細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有很顯著的變化,只是細(xì)胞的一些成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)消失了,轉(zhuǎn)而變化為向四周擴(kuò)展的扁平狀的細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)誘導(dǎo)后的第21d,鏡下發(fā)現(xiàn)了許多圓形和成梭形的細(xì)胞,其細(xì)胞形態(tài)與肝細(xì)胞相似,并經(jīng)肝細(xì)胞的若干分子表達(dá)鑒定,鑒定的結(jié)果表明在細(xì)胞生長(zhǎng)最初階段,BMSCs只表達(dá)Bst-1。在經(jīng)誘導(dǎo)分化后的11d時(shí)BMSCs的M2-PK和GST-P(幼稚肝細(xì)胞標(biāo)志)都被表達(dá)了,當(dāng)分化方向確定后的20d時(shí)檢測(cè)到BMSCs的Albumin(成熟肝細(xì)胞標(biāo)志)的mRNA被表達(dá),相反BMSCs中BST-1的mRNA則在誘導(dǎo)后未檢測(cè)到。而在對(duì)照組,BMSC在整個(gè)分化過(guò)程中只表達(dá)Bst-1這一髓源分子證明對(duì)照組的BMSCs未被分化保持著B(niǎo)MSCs的細(xì)胞特性。以上的實(shí)驗(yàn)表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在經(jīng)肝損模型的誘導(dǎo)后可以向肝細(xì)胞分化。同時(shí)在加入Jagged1共培養(yǎng)的BMSCs中實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯上調(diào)Notch信號(hào)通路,促進(jìn)下游基因Hes1/Hey1的mRNA的表達(dá)；另外一組加入DAPT可以顯著阻斷Notch信號(hào)通路,抑制下游基因Hesl/Heyl的]mRNA的表達(dá)。分析BMSCs分化狀態(tài)后實(shí)驗(yàn)組直到26天都未表達(dá)Albumin(成熟肝細(xì)胞標(biāo)志)正常組只需要21天。 結(jié)論： 這些結(jié)果證明在BMSCs向肝分化過(guò)程中必須有Notch信號(hào)通路的參與。Notch信號(hào)可能對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化起到了抑制作用。Nocth信號(hào)通路的下調(diào)可能有助于BMSCs的向肝細(xì)胞分化。為體外獲得大量肝細(xì)胞提供了有力的基礎(chǔ),對(duì)需要肝細(xì)胞移植的疾病提供了重要工具。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Notch信號(hào)通路 肝細(xì)胞 定向分化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-18
• 材料和方法18-30
• 1.1 材料18-22
• 1.2 方法22-30
• 結(jié)果30-38
• 2.1 肝損動(dòng)物模型的構(gòu)建30
• 2.2 分化誘導(dǎo)液的獲得30
• 2.3 大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的獲得30-32
• 2.4 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的肝向誘導(dǎo)分化32-34
• 2.5 誘導(dǎo)分化所得細(xì)胞分化狀態(tài)的確定34-35
• 2.6 Notch信號(hào)對(duì)BMSCs肝向分化的影響35-38
• 討論38-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 綜述51-56
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 中英文對(duì)照縮寫詞表56-57
• 在讀期間發(fā)表論著57-58
• 致謝58-59

【參考文獻(xiàn)】

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1 張琦,鄭志z，

本文編號(hào)：275085