本文關(guān)鍵詞：SLC26A家族的電壓依賴性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：哺乳動(dòng)物的聽覺具有高度的靈敏度和精確性,這是因?yàn)樗鼉?nèi)耳的耳蝸具有放大功能,而驅(qū)動(dòng)耳蝸放大的基礎(chǔ)就是外毛細(xì)胞的電致運(yùn)動(dòng)。哺乳動(dòng)物的外毛細(xì)胞可以在電刺激下改變其自身的長度此即為電致運(yùn)動(dòng)。電致運(yùn)動(dòng)的分子馬達(dá)是外毛細(xì)胞的膜組成蛋白prestin。當(dāng)電壓改變時(shí),外毛細(xì)胞胞內(nèi)的氯離子受電壓驅(qū)動(dòng)而進(jìn)出prestin蛋白,導(dǎo)致prestin發(fā)生構(gòu)象變化,最終使得外毛細(xì)胞出現(xiàn)伸縮運(yùn)動(dòng)。與電致運(yùn)動(dòng)相聯(lián)系的電記號(hào)是電壓依賴性的膜電容也稱為非線性膜電容(Nonlinear capacitance, NLC)。 根據(jù)核苷酸序列分析可以將prestin歸為溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體26A家族(SLC26A), prestin是其第五個(gè)成員�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)SLC26A家族有11個(gè)成員(A1-A11),它們分布在不同組織的上皮細(xì)胞上且均為膜蛋白。它們的結(jié)構(gòu)非常相似包括：胞質(zhì)內(nèi)的N-端、C-端以及結(jié)構(gòu)未知的跨膜區(qū)域。結(jié)構(gòu)的相似性也預(yù)示著它們的功能可能非常相似。在哺乳動(dòng)物中,SLC26A家族成員的功能分為兩類,一類是轉(zhuǎn)運(yùn)陰離子的功能,一類是prestin (A5)所特有的運(yùn)動(dòng)功能。而在非哺乳類脊椎動(dòng)物中prestin (A5)與其它成員類似只具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能。因此,我們推測(cè)prestin(A5)的運(yùn)動(dòng)功能可能是進(jìn)化而來的。另外,哺乳動(dòng)物prestin (A5)運(yùn)動(dòng)功能的產(chǎn)生與其電壓依賴性密切相關(guān),它是先感受膜電位的變化再產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)的,也就是說電壓依賴性是其產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)功能的基礎(chǔ)。那么,prestin (A5)的電壓依賴性是其特有的還是整個(gè)SLC26A家族所共有的呢?為了解決這一問題,我們需要研究SLC26A家族其它成員的電壓依賴性。 我們用已知的SLC26A家族成員的蛋白序列做了一個(gè)無根的系統(tǒng)進(jìn)化樹并從系統(tǒng)進(jìn)化樹的每個(gè)分支中選擇一個(gè)成員(A2, A4, A6, A7, A9, A11)作為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)選取人胚腎293細(xì)胞(HEK-293)轉(zhuǎn)染所選取的SLC26A家族基因的,使其表達(dá)后,用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄其膜電容,以了解SLC26A家族的電壓依賴性。實(shí)驗(yàn)的第一步是構(gòu)建并提取目的質(zhì)粒。我們首先將目的基因與綠色熒光蛋白載體連接,然后通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取步驟獲得目的質(zhì)粒。第二步是將目的質(zhì)粒用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染成功的HEK-293細(xì)胞其細(xì)胞膜會(huì)發(fā)出綠色熒光。第三步是采用單細(xì)胞膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù),給予轉(zhuǎn)染成功的HEK-293細(xì)胞兩個(gè)正弦波電壓刺激(峰值為10mV,頻率為390.6和781.2赫茲),記錄其膜電容,然后分析比較各成員的膜電容,以了解其電壓依賴性。同時(shí),我們通過改變細(xì)胞內(nèi)外液的離子成分,來了解膜電容的變化與離子的關(guān)系。 我們將A5(prestin)作為陽性對(duì)照而把只轉(zhuǎn)染有綠色熒光蛋白的HEK-293細(xì)胞作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中在細(xì)胞內(nèi)外液均含C1-的情況下記錄到的細(xì)胞數(shù)如下：A2為13個(gè),A4為8個(gè),A5(prestin)為9個(gè),A6為15個(gè),A7為11個(gè),A9為10個(gè),A11為8個(gè)。在分別表達(dá)有A2,A4,A6,A7,A9或A11的HEK-293細(xì)胞上均記錄到非線性膜電容(NLC),即本實(shí)驗(yàn)所選取的SLC26A家族成員都有電壓依賴性。對(duì)NLC用Boltzmann方程擬合并將所得到的參數(shù)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)化的NLC (NLC/Clin)最大的是A5(prestin),為7.80±3.27(mean±SD)；最小的是A2,為1.65±0.70;與A5(prestin)最接近的是A6,為6.94±2.30。而標(biāo)準(zhǔn)化的最大電荷移動(dòng)(Qmax/Clin),峰值電壓(W1/2)以及z值(曲線斜率)與A5(prestin)比較接近的也是A6(A5:12.72±4.61fC/pF,-69.79±8.30mV和0.70±0.07; A6:12.02±3.28fC/pF,-41.74±17.12mV和0.55±0.08)。從以上結(jié)果可以得出A6與A5(prestin)的電壓依賴性最為相似,這與系統(tǒng)進(jìn)化樹所顯示的A5(prestin)與A6的親緣關(guān)系最近是相一致的。 由于A5(prestin)和A6在電壓依賴性方面具有相似性,而A6與其它SLC26A家族成員在功能方面具有相似性,因此A6作為連接A5(prestin)與SLC26A家族的橋梁值得我們重點(diǎn)研究。對(duì)于prestin (A5)來說,胞內(nèi)的C1-是其主要的電壓感受性的離子,其NLC是由于胞內(nèi)C1-在電壓驅(qū)動(dòng)下在蛋白內(nèi)移動(dòng)而產(chǎn)生的。如果將細(xì)胞內(nèi)液中的C1-用戊烷磺酸鈉替換掉其NLC會(huì)減少甚至消失。我們用同樣的方法處理并記錄表達(dá)有A6的HEK-293細(xì)胞,觀察其NLC的變化,發(fā)現(xiàn)：用戊烷磺酸鈉替換C1-后A6的NLC并沒有出現(xiàn)顯著的變化。而且從Boltzmann方程擬合得到的參數(shù)V1/2, z, Qmax/Clin和NLC/Clin來看,兩者也都沒有顯著性差異(P值分別為0.718、0.143、0.138、0.534,t檢驗(yàn))。這說明可能是胞外的C1-進(jìn)入了蛋白或其它的離子參與NLC的產(chǎn)生。為了驗(yàn)證以上推測(cè),我們給予細(xì)胞1mmol的DIDS以阻斷蛋白通道,發(fā)現(xiàn)在加入DIDS后,A6的NLC (n=4)有明顯的下降(并沒有完全消失),且與細(xì)胞內(nèi)液中含C1-或不含C1-所記錄到的NLC均有顯著性差異(P0.05,t檢驗(yàn))。以上結(jié)果說明,A6的NLC主要是由胞外電壓感受性的C1-在蛋白內(nèi)移動(dòng)而產(chǎn)生的,其它離子也可能少量參與。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的想法,我們以NLC最小的A2作為研究對(duì)象,探究C1-以外的離子對(duì)其NLC的貢獻(xiàn)。我們?cè)谕庖褐屑尤隨042-進(jìn)行記錄,發(fā)現(xiàn)在加入8042-后標(biāo)準(zhǔn)化的NLC (n=13)有明顯的增大,是僅含C1-的2倍左右,兩者有顯著性差異(P0.01,t檢驗(yàn))。為了進(jìn)一步明確這一現(xiàn)象我們又同時(shí)記錄了A11,因?yàn)槿祟惖腁11特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)SO42-。與A2類似,當(dāng)細(xì)胞外液中含8042-時(shí),A11標(biāo)準(zhǔn)化的NLC (n=11)也明顯增大,約為僅含C1-的2倍,兩者有顯著性差異(P0.05,t檢驗(yàn))。加入8042-后NLC是原來的兩倍,我們認(rèn)為這可能是由于S042-本身帶兩個(gè)電荷所引起。由此我們可以得出C1-并不是SLC26A家族唯一的電壓感受性的離子。 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論：1.在SLC26A家族中,A5(prestin)和A6的親緣關(guān)系最近。2.電壓依賴性是SLC26A家族的共有特性且A5和A6最為相似。3. SLC26A家族電壓依賴性的產(chǎn)生機(jī)制是電壓敏感性的離子在蛋白內(nèi)移動(dòng)。4.C1-并不是SLC26A家族中唯一的電壓感受性的離子。以上這些結(jié)論說明SLC26A轉(zhuǎn)運(yùn)體是一種電壓門控性的轉(zhuǎn)運(yùn)體,其基因序列中可能有一段編碼電壓感受的保守序列且它可能對(duì)其電壓感受性的離子沒有選擇性。
【關(guān)鍵詞】：Prestin 溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體26A家族 電壓依賴性 非線性膜電容
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R338.3
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 綜述：Prestin和它的SLC26A家族13-42
• 1.1 SLC26A家族的研究簡(jiǎn)史13-14
• 1.2 SLC26A家族的結(jié)構(gòu)14-15
• 1.3 SLC26A家族的分布、功能及調(diào)控機(jī)制15-21
• 1.4 SLC26A家族的相關(guān)疾病21-25
• 1.5 發(fā)展前景25-26
• 參考文獻(xiàn)26-42
• 第二章 SLC26A家族的電壓依賴性42-66
• 2.1 引言42-45
• 2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)45-47
• 2.3 實(shí)驗(yàn)材料和方法47-54
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-61
• 2.5 討論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 中英文對(duì)照縮略詞表66-67
• 論文發(fā)表情況67-68
• 致謝68-69

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1 何艷,李長平,張文杰,孫小霞,鐘國贛;人外周血淋巴細(xì)胞電壓依賴性鉀通道電流的記錄及其特性[J];白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1999年02期

2 吳新生,何淑舫;G蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞電壓依賴性離子通道的直接調(diào)制作用[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1997年01期

3 李俊英;;鈣通道Cav3.1的S4區(qū)域在其電壓依賴性失活過程中的作用[J];科學(xué)通報(bào);2007年08期

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1 李俊英;;決定鈣離子通道電壓依賴性激活的分子結(jié)構(gòu)域的研究[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)2004年年會(huì)論文集[C];2005年

2 高青華;黃世錚;趙美瞇;郭鳳;郝麗英;;壬基苯酚對(duì)GH3細(xì)胞電壓依賴性鉀離子通道電流的影響及作用機(jī)制[A];中國生理學(xué)會(huì)第23屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要文集[C];2010年

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1 范超;SLC26A家族的電壓依賴性[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：SLC26A家族的電壓依賴性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：275070