本文關(guān)鍵詞：SLC26A家族的電壓依賴性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：哺乳動物的聽覺具有高度的靈敏度和精確性,這是因為它內(nèi)耳的耳蝸具有放大功能,而驅(qū)動耳蝸放大的基礎(chǔ)就是外毛細(xì)胞的電致運動。哺乳動物的外毛細(xì)胞可以在電刺激下改變其自身的長度此即為電致運動。電致運動的分子馬達(dá)是外毛細(xì)胞的膜組成蛋白prestin。當(dāng)電壓改變時,外毛細(xì)胞胞內(nèi)的氯離子受電壓驅(qū)動而進出prestin蛋白,導(dǎo)致prestin發(fā)生構(gòu)象變化,最終使得外毛細(xì)胞出現(xiàn)伸縮運動。與電致運動相聯(lián)系的電記號是電壓依賴性的膜電容也稱為非線性膜電容(Nonlinear capacitance, NLC)。 根據(jù)核苷酸序列分析可以將prestin歸為溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體26A家族(SLC26A), prestin是其第五個成員�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)SLC26A家族有11個成員(A1-A11),它們分布在不同組織的上皮細(xì)胞上且均為膜蛋白。它們的結(jié)構(gòu)非常相似包括：胞質(zhì)內(nèi)的N-端、C-端以及結(jié)構(gòu)未知的跨膜區(qū)域。結(jié)構(gòu)的相似性也預(yù)示著它們的功能可能非常相似。在哺乳動物中,SLC26A家族成員的功能分為兩類,一類是轉(zhuǎn)運陰離子的功能,一類是prestin (A5)所特有的運動功能。而在非哺乳類脊椎動物中prestin (A5)與其它成員類似只具有轉(zhuǎn)運功能。因此,我們推測prestin(A5)的運動功能可能是進化而來的。另外,哺乳動物prestin (A5)運動功能的產(chǎn)生與其電壓依賴性密切相關(guān),它是先感受膜電位的變化再產(chǎn)生運動的,也就是說電壓依賴性是其產(chǎn)生運動功能的基礎(chǔ)。那么,prestin (A5)的電壓依賴性是其特有的還是整個SLC26A家族所共有的呢?為了解決這一問題,我們需要研究SLC26A家族其它成員的電壓依賴性。 我們用已知的SLC26A家族成員的蛋白序列做了一個無根的系統(tǒng)進化樹并從系統(tǒng)進化樹的每個分支中選擇一個成員(A2, A4, A6, A7, A9, A11)作為研究對象。本實驗選取人胚腎293細(xì)胞(HEK-293)轉(zhuǎn)染所選取的SLC26A家族基因的,使其表達(dá)后,用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄其膜電容,以了解SLC26A家族的電壓依賴性。實驗的第一步是構(gòu)建并提取目的質(zhì)粒。我們首先將目的基因與綠色熒光蛋白載體連接,然后通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取步驟獲得目的質(zhì)粒。第二步是將目的質(zhì)粒用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染進HEK-293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染成功的HEK-293細(xì)胞其細(xì)胞膜會發(fā)出綠色熒光。第三步是采用單細(xì)胞膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù),給予轉(zhuǎn)染成功的HEK-293細(xì)胞兩個正弦波電壓刺激(峰值為10mV,頻率為390.6和781.2赫茲),記錄其膜電容,然后分析比較各成員的膜電容,以了解其電壓依賴性。同時,我們通過改變細(xì)胞內(nèi)外液的離子成分,來了解膜電容的變化與離子的關(guān)系。 我們將A5(prestin)作為陽性對照而把只轉(zhuǎn)染有綠色熒光蛋白的HEK-293細(xì)胞作為陰性對照。實驗中在細(xì)胞內(nèi)外液均含C1-的情況下記錄到的細(xì)胞數(shù)如下：A2為13個,A4為8個,A5(prestin)為9個,A6為15個,A7為11個,A9為10個,A11為8個。在分別表達(dá)有A2,A4,A6,A7,A9或A11的HEK-293細(xì)胞上均記錄到非線性膜電容(NLC),即本實驗所選取的SLC26A家族成員都有電壓依賴性。對NLC用Boltzmann方程擬合并將所得到的參數(shù)進行比較后發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)化的NLC (NLC/Clin)最大的是A5(prestin),為7.80±3.27(mean±SD)；最小的是A2,為1.65±0.70;與A5(prestin)最接近的是A6,為6.94±2.30。而標(biāo)準(zhǔn)化的最大電荷移動(Qmax/Clin),峰值電壓(W1/2)以及z值(曲線斜率)與A5(prestin)比較接近的也是A6(A5:12.72±4.61fC/pF,-69.79±8.30mV和0.70±0.07; A6:12.02±3.28fC/pF,-41.74±17.12mV和0.55±0.08)。從以上結(jié)果可以得出A6與A5(prestin)的電壓依賴性最為相似,這與系統(tǒng)進化樹所顯示的A5(prestin)與A6的親緣關(guān)系最近是相一致的。 由于A5(prestin)和A6在電壓依賴性方面具有相似性,而A6與其它SLC26A家族成員在功能方面具有相似性,因此A6作為連接A5(prestin)與SLC26A家族的橋梁值得我們重點研究。對于prestin (A5)來說,胞內(nèi)的C1-是其主要的電壓感受性的離子,其NLC是由于胞內(nèi)C1-在電壓驅(qū)動下在蛋白內(nèi)移動而產(chǎn)生的。如果將細(xì)胞內(nèi)液中的C1-用戊烷磺酸鈉替換掉其NLC會減少甚至消失。我們用同樣的方法處理并記錄表達(dá)有A6的HEK-293細(xì)胞,觀察其NLC的變化,發(fā)現(xiàn)：用戊烷磺酸鈉替換C1-后A6的NLC并沒有出現(xiàn)顯著的變化。而且從Boltzmann方程擬合得到的參數(shù)V1/2, z, Qmax/Clin和NLC/Clin來看,兩者也都沒有顯著性差異(P值分別為0.718、0.143、0.138、0.534,t檢驗)。這說明可能是胞外的C1-進入了蛋白或其它的離子參與NLC的產(chǎn)生。為了驗證以上推測,我們給予細(xì)胞1mmol的DIDS以阻斷蛋白通道,發(fā)現(xiàn)在加入DIDS后,A6的NLC (n=4)有明顯的下降(并沒有完全消失),且與細(xì)胞內(nèi)液中含C1-或不含C1-所記錄到的NLC均有顯著性差異(P0.05,t檢驗)。以上結(jié)果說明,A6的NLC主要是由胞外電壓感受性的C1-在蛋白內(nèi)移動而產(chǎn)生的,其它離子也可能少量參與。 為了進一步驗證我們的想法,我們以NLC最小的A2作為研究對象,探究C1-以外的離子對其NLC的貢獻(xiàn)。我們在外液中加入S042-進行記錄,發(fā)現(xiàn)在加入8042-后標(biāo)準(zhǔn)化的NLC (n=13)有明顯的增大,是僅含C1-的2倍左右,兩者有顯著性差異(P0.01,t檢驗)。為了進一步明確這一現(xiàn)象我們又同時記錄了A11,因為人類的A11特異性的轉(zhuǎn)運SO42-。與A2類似,當(dāng)細(xì)胞外液中含8042-時,A11標(biāo)準(zhǔn)化的NLC (n=11)也明顯增大,約為僅含C1-的2倍,兩者有顯著性差異(P0.05,t檢驗)。加入8042-后NLC是原來的兩倍,我們認(rèn)為這可能是由于S042-本身帶兩個電荷所引起。由此我們可以得出C1-并不是SLC26A家族唯一的電壓感受性的離子。 綜上所述,本實驗得出以下結(jié)論：1.在SLC26A家族中,A5(prestin)和A6的親緣關(guān)系最近。2.電壓依賴性是SLC26A家族的共有特性且A5和A6最為相似。3. SLC26A家族電壓依賴性的產(chǎn)生機制是電壓敏感性的離子在蛋白內(nèi)移動。4.C1-并不是SLC26A家族中唯一的電壓感受性的離子。以上這些結(jié)論說明SLC26A轉(zhuǎn)運體是一種電壓門控性的轉(zhuǎn)運體,其基因序列中可能有一段編碼電壓感受的保守序列且它可能對其電壓感受性的離子沒有選擇性。
【關(guān)鍵詞】：Prestin 溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體26A家族 電壓依賴性 非線性膜電容
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R338.3
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 綜述：Prestin和它的SLC26A家族13-42
• 1.1 SLC26A家族的研究簡史13-14
• 1.2 SLC26A家族的結(jié)構(gòu)14-15
• 1.3 SLC26A家族的分布、功能及調(diào)控機制15-21
• 1.4 SLC26A家族的相關(guān)疾病21-25
• 1.5 發(fā)展前景25-26
• 參考文獻(xiàn)26-42
• 第二章 SLC26A家族的電壓依賴性42-66
• 2.1 引言42-45
• 2.2 實驗設(shè)計45-47
• 2.3 實驗材料和方法47-54
• 2.4 實驗結(jié)果54-61
• 2.5 討論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 中英文對照縮略詞表66-67
• 論文發(fā)表情況67-68
• 致謝68-69

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  本文關(guān)鍵詞：SLC26A家族的電壓依賴性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：275070