發(fā)布時(shí)間：2017-03-29 05:07

  本文關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)M型丙酮酸激酶功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丙酮酸激酶(PK)是糖酵解過(guò)程中的最后一個(gè)關(guān)鍵限速酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)產(chǎn)生一分子丙酮酸和一分子腺苷三磷酸(ATP)。在哺乳動(dòng)物中,丙酮酸激酶分為PKLR和PKM兩種形式,PKM又根據(jù)剪接方式的不同分為PKMl和PKM2,分別包含外顯子9和外顯子10。PKM1主要表達(dá)于高耗能組織如心臟、骨髂肌和腦組織,PKM2則主要表達(dá)于胚胎組織和快速增殖的腫瘤細(xì)胞中。近年來(lái)研究表明PKM2不僅作為丙酮酸激酶參與糖酵解過(guò)程,而且還具有蛋白激酶的活性。PKM2現(xiàn)已成為熱門(mén)研究領(lǐng)域,科學(xué)家主要集中在研究PKM2在腫瘤細(xì)胞中的作用。研究發(fā)現(xiàn),PKM2參與腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng),使腫瘤細(xì)胞在氧氣存在的情況下也通過(guò)有氧糖酵解的方式進(jìn)行代謝。PKM2主要以二聚體和四聚體兩種形式發(fā)揮作用,在正常細(xì)胞中,PKM2主要以四聚體形式存在,具有丙酮酸激酶的活性,而二聚體形式的PKM2主要存在于腫瘤細(xì)胞中,具有蛋白激酶的活性。近年來(lái)的研究已經(jīng)證實(shí),PKM2在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要功能,其作用機(jī)理已經(jīng)被基本闡明,成為近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)。研究表明,缺氧能上調(diào)腫瘤細(xì)胞PKM2的表達(dá)水平,并且也已證實(shí)PKM2是HIF-1α直接調(diào)控的靶基因。經(jīng)生物信息學(xué)分析,在PKM2的第一個(gè)內(nèi)含子上有一個(gè)缺氧反應(yīng)元件(HRE),可被缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1α)識(shí)別,從而調(diào)節(jié)PKM2的轉(zhuǎn)錄激活。對(duì)PKM2的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其羧基端具有核定位信號(hào)Arg399/400,在缺氧條件下會(huì)進(jìn)到細(xì)胞核中發(fā)揮作用。在核內(nèi),PKM2和HIF-1α相互作用,激活HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性,從而促進(jìn)HIF-1α靶基因的轉(zhuǎn)錄,包括和糖酵解相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子以及乳酸脫氫酶A,PKM2作為HIF-1α的靶基因,其轉(zhuǎn)錄活性也會(huì)被調(diào)控,這樣就在PKM2和HIF-1α之間形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)。然而,盡管PKM2與HIF-1α能夠相互作用已經(jīng)毋庸置疑,但是這些研究都是在體外細(xì)胞中進(jìn)行的,至今尚無(wú)體內(nèi)研究證明二者相互作用及體內(nèi)生物學(xué)功能,尤其PKM2是否在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用,其是否參與了HIF在胚胎發(fā)育中的作用還是空白�，F(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為,腫瘤是發(fā)育生物學(xué)問(wèn)題。PKM2既然對(duì)腫瘤至關(guān)重要,推測(cè)其在胚胎發(fā)育中極有可能發(fā)揮重要作用。而斑馬魚(yú)作為新型模式動(dòng)物,在發(fā)育生物學(xué)的應(yīng)用相當(dāng)廣泛。斑馬魚(yú)基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,在斑馬魚(yú)存在兩個(gè)pkm基因,命名為pkma和pkmb,分別位于斑馬魚(yú)18號(hào)、25號(hào)染色體。結(jié)構(gòu)分析表明,其與哺乳動(dòng)物高度保守。其中,斑馬魚(yú)中pkma基因又分為兩個(gè)剪切本(Transcript),根據(jù)其cDNA堿基數(shù)分別命名為pkma-2404、pkma-2412,是同一基因pkma在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中由前體mRNA經(jīng)過(guò)不同的選擇性剪切的產(chǎn)物。pkma-2412包含外顯子10,pkma-2404不含外顯子10但特異含有原內(nèi)含子9的一部分。通過(guò)生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)在pkma和pkmb上都存在核定位信號(hào),并且在序列上游都存在HRE。通過(guò)RT-PCR我們發(fā)現(xiàn)pkma-2404和pkmb在胚胎發(fā)育時(shí)期和成魚(yú)體內(nèi)都有表達(dá),而pkma-2412只在胚胎發(fā)育早期和成魚(yú)體內(nèi)有表達(dá)。然后我們又通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎和成魚(yú)分別進(jìn)行缺氧發(fā)現(xiàn)pkma和pkmb都受缺氧調(diào)控,將帶有GFP標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞,以p2.1作為報(bào)告質(zhì)粒,然后檢測(cè)雙熒光素酶的活性發(fā)現(xiàn),Pkma能使雙熒光素酶的活性顯著上升,說(shuō)明Pkma能與HIF-1α相互作用。我們通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞還發(fā)現(xiàn),Pkma和Pkmb在缺氧條件下可以進(jìn)入到細(xì)胞核。之后,我們通過(guò)斑馬魚(yú)胚胎過(guò)表達(dá)HIF-1α發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)HIF-1α能上調(diào)pkma mRNA的表達(dá)水平,推測(cè)pkma是HIF-1α的靶基因。綜上所述,斑馬魚(yú)pkm基因是受缺氧調(diào)控的,從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了pkma可能是HIF-1α的靶基因,并且我們對(duì)pkm在胚胎發(fā)育早期的功能也有了一定的認(rèn)識(shí)。
【關(guān)鍵詞】：M型丙酮酸激酶 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 缺氧 斑馬魚(yú)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：Q55;R363
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 前言12-28
• 1.1 模式動(dòng)物——斑馬魚(yú)12-13
• 1.2 丙酮酸激酶(PK)13-18
• 1.2.1 丙酮酸激酶簡(jiǎn)介13
• 1.2.2 PKM的可變剪接機(jī)制13
• 1.2.3 PKM2的活性13-14
• 1.2.4 PKM2在基因轉(zhuǎn)錄和腫瘤發(fā)生的功能14-16
• 1.2.5 核定位信號(hào)與PKM2的進(jìn)核機(jī)制16-18
• 1.2.6 PKM2作為治療腫瘤的新靶點(diǎn)18
• 1.3 斑馬魚(yú)pkm基因18
• 1.4 缺氧與缺氧誘導(dǎo)因子(HIFs)18-24
• 1.4.1 缺氧18-19
• 1.4.2 缺氧手段19
• 1.4.3 生物體對(duì)缺氧的應(yīng)答機(jī)制19-20
• 1.4.4 HIF-1的結(jié)構(gòu)20
• 1.4.5 HIF-1的活性20-21
• 1.4.6 缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia Response Elements,HRE)21
• 1.4.7 HIF一1的靶基因21
• 1.4.8 HIF-1與PKM2的關(guān)系21-23
• 1.4.9 HIF-1α與腫瘤的關(guān)系23-24
• 1.5 CRISPR/Cas9技術(shù)24-25
• 1.6 本論文的立題依據(jù)25-27
• 1.7 本論文的研究意義27-28
• 2 斑馬魚(yú)pkm在早期胚胎發(fā)育的研究28-55
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法28-43
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 2.1.2 主要化學(xué)和生物試劑28
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器28-29
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法29-43
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-51
• 2.2.1 斑馬魚(yú)pkma/pkmb的序列分析43-44
• 2.2.2 斑馬魚(yú)pkma/pkmb的時(shí)空表達(dá)譜分析44-45
• 2.2.3 缺氧對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)和胚胎pkm mRNA表達(dá)水平的影響45-46
• 2.2.4 斑馬魚(yú)Pkma與HIF-1α有相互作用46-49
• 2.2.5 pkma是HIF-1α的靶基因49-50
• 2.2.6 利用Cas9技術(shù)構(gòu)建Pkmb敲除的突變體50-51
• 2.3 總結(jié)與討論51-55
• 2.3.1 pkma/pkmb在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期有表達(dá)51-52
• 2.3.2 缺氧能上調(diào)pkma/pkmb的表達(dá)以及Pkma/Pkmb和HIF-1α相互作用52-53
• 2.3.3 缺氧能誘導(dǎo)Pkma/Pkmb入核53-54
• 2.3.4 運(yùn)用Cas9基因敲除技術(shù)構(gòu)建Pkma/Pkmb功能缺失的突變體54-55
• 3 展望55-57
• 3.1 確定pkma/pkmb在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中的功能及機(jī)制55
• 3.2 探究Pkma/Pkmb是否和HIF-1α相互作用55-56
• 3.3 Pkma/Pkmb在胚胎發(fā)育中的作用是否與HIF信號(hào)通路相關(guān)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 致謝62-64
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷64
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文64

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