【摘要】： 前言 先天性甲狀腺功能減低癥(先天性甲低)是兒科常見的內(nèi)分泌代謝性疾病之一,是由于各種原因?qū)е孪忍煨约谞钕俜置诘募谞钕偌に?TH)不足引起,是造成兒童智力障礙的原因之一,一直是兒童內(nèi)分泌醫(yī)務(wù)人員關(guān)注的重點。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,我們對TH的生理作用有了更深入的了解,TH在細(xì)胞核內(nèi)與其受體(TR)結(jié)合,作用于靶基因啟動子的甲狀腺激素反應(yīng)元件(TREs),在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),然而甲低具體通過影響哪些基因,從而導(dǎo)致兒童智力障礙的機(jī)制目前尚不十分清楚。信號蛋白和相關(guān)的功能蛋白是細(xì)胞各種信息傳導(dǎo)及各種功能代謝活動的執(zhí)行者,為神經(jīng)細(xì)胞生長、分化等活動的基礎(chǔ),也是神經(jīng)感覺、運動、學(xué)習(xí)和記憶等功能活動形成機(jī)制的重要環(huán)節(jié),深入研究TH對腦組織信號系統(tǒng)相關(guān)蛋白的基因?qū)W調(diào)節(jié),能更全面地揭示甲狀腺調(diào)控腦發(fā)育機(jī)制和先天性甲低的發(fā)病機(jī)制。 神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)典的細(xì)胞信號連接主要指突觸部位的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞,以往研究表明TH參與多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成、降解,以及遞質(zhì)受體表達(dá)和功能。事實上,神經(jīng)系統(tǒng)還存在一些非經(jīng)典的信號傳導(dǎo)系統(tǒng),如縫隙連接(GJ),它們也介導(dǎo)了神經(jīng)系統(tǒng)的一些重要功能。GJ是構(gòu)成相鄰細(xì)胞間的細(xì)胞縫隙連接通訊(GJC)——一種電突觸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。GJ關(guān)鍵成分是縫隙連接蛋白(Cx),其結(jié)構(gòu)單位是由6個Cx亞單位構(gòu)成連接子,相鄰的細(xì)胞膜對應(yīng)面上的一對連接子構(gòu)成GJ通道-直徑約1.5nm的親水性通道。神經(jīng)系統(tǒng)有豐富的GJ,至少有12種Cx在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá),以Cx43最多,占90-95%,然而不同神經(jīng)細(xì)胞上Cx分布存在差異,其中星形膠質(zhì)細(xì)胞上主要是Cx43,少突膠質(zhì)細(xì)胞上主要表達(dá)Cx32,神經(jīng)元上主要表達(dá)Cx36,最近發(fā)現(xiàn)Cx45也有在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá),數(shù)量也比較豐富。 研究表明,星形膠質(zhì)細(xì)胞通過GJ相互連接形成功能合胞體,GJ還可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)構(gòu)成復(fù)雜的神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元的信息網(wǎng)絡(luò),GJ連通相互耦聯(lián)細(xì)胞的胞漿,允許一些小分子物質(zhì)在細(xì)胞間通過,為細(xì)胞間物質(zhì)傳遞和信息交流提供了直接通路,還有部分連接子并沒有與相鄰細(xì)胞形成GJ,直接與細(xì)胞外接觸,是細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換和信息交流的一種直接通道。GJ在維持內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定、協(xié)調(diào)神經(jīng)元功能方面起著非常重要的作用,在神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育和生理功能的調(diào)節(jié)中也起重要作用,而且是腦內(nèi)長短信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),已經(jīng)證實許多疾病與GJ功能異常有關(guān)。研究表明GJ的通透功能可塑性比較大,先前研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素可能影響心肌細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞Cx43的表達(dá),但結(jié)果也尚有爭議。然而,至今尚無有關(guān)TH對中樞神經(jīng)系統(tǒng)Cx表達(dá)影響的報道。 為此,我們首先通過建立先天性甲狀腺功能減低癥的動物模型,檢測先天性甲低對大腦皮層Cx43、Cx32和Cx45表達(dá)的影響。再應(yīng)用離體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),觀察不同甲狀腺素濃度對大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43、Cx32和Cx45表達(dá)的影響,以進(jìn)一步了解TH對星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43、Cx32和Cx45表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,為深入研究先天性甲低發(fā)病機(jī)制和保護(hù)干預(yù)措施等提供實驗依據(jù)。 研究目的 通過檢測先天性甲低仔鼠大腦皮層Cx43、Cx32和Cx45表達(dá),以及不同甲狀腺素濃度培養(yǎng)對大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43、Cx32和Cx45表達(dá)變化,探討先天性甲低對這些縫隙連接蛋白表達(dá)的影響。 動物模型部分 1材料與方法 1.1動物模型建立和分組 清潔級健康成年C57BL／6J合籠交配后自行產(chǎn)子,按處理條件不同分甲低組和對照組。 甲低組：合籠第10天開始給予母鼠含0.03%甲巰咪唑的飲用水,一直到仔鼠出生7天。 對照組：一直喂養(yǎng)清潔飲用水,其它實驗控制因素同甲低組。 在仔鼠出生1、7、14和21天麻醉后處死,生理鹽水灌注,留取大腦皮層標(biāo)本。 1.2指標(biāo)檢測 采用Real time RT-PCR法檢測Cx43、Cx32和Cx45的mRNA水平。采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒提取腦組織總RNA,自行設(shè)計引物,應(yīng)用Takara熒光PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(兩步法)。目的基因mRNA水平采用ΔCt表示。 采用Western blot法檢測Cx43、Cx32和Cx45的蛋白質(zhì)水平。應(yīng)用RIPA裂解液提取腦組織蛋白質(zhì),采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,在丙烯酰胺電泳和轉(zhuǎn)膜后,依次封閉、一抗和二抗孵育、放射自顯影,保存膠片,最后統(tǒng)一將放射自顯影條帶進(jìn)行掃描,對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析,將Cx/β-actin的比值作為Cx的相對表達(dá)量。 新鮮腦組織予10%中性福爾馬林固定和石蠟包埋,采用"EnvisionTM二步法”進(jìn)行免疫組化檢測。 2結(jié)果 對照組出生后Cx43表達(dá)上升,7天時達(dá)到高峰,此后基本維持穩(wěn)定水平；而甲低組出生后Cx43表達(dá)上升較慢。與對照組比較,1、7和14天甲低組Cx43mRNA有所下降,但差異均不具有顯著性意義。1和7天甲低組Cx43蛋白質(zhì)有下降,其中1天時差異在邊界水平,7天時差異具有顯著性意義。免疫組化顯示大腦皮層Cx43表達(dá)均非常豐富,廣泛分布在神經(jīng)細(xì)胞的胞體和神經(jīng)纖維部位。 對照組大腦皮層Cx32表達(dá)水平相對較低,在出生后進(jìn)一步呈逐漸下降趨勢。甲低組在7、14和21天時Cx32 mRNA均有明顯升高。不同日齡甲低組Cx32蛋白質(zhì)均有上升,其中7日齡時差異具有顯著性意義,14日齡時差異在邊界水平。免疫組化顯示大腦皮層的Cx32表達(dá)明顯較Cx43低,部分神經(jīng)元胞體和少量神經(jīng)纖維陽性。 對照組大腦皮層Cx45水平處于Cx45和Cx32間,出生后也逐漸下降。兩組間不同時間點Cx45mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)差異均無顯著意義。免疫組化顯示大腦皮層Cx45表達(dá)比較豐富,也較廣泛分布于神經(jīng)細(xì)胞胞體和纖維部位。 細(xì)胞培養(yǎng)部分 1材料和方法 1.1培養(yǎng)基配制 購買活性炭吸附后低甲狀腺激素胎牛血清(FBS)和未特殊處理的胎牛血清,同時購買T3配制T3終濃度為5 nmol/L的DMEM液。按下列方法配制各種培養(yǎng)液,并測定各組培養(yǎng)液總T3(TT3)和游離T3(FT3)甲狀腺激素濃度。 培養(yǎng)基Ⅰ：普通DMEM+15%普通FBS(TT3:5.4nmol/L, FT3:22.0pmol/L); 培養(yǎng)基Ⅱ：普通DMEM+15%低TH的FBS(TT3:0.6 nmol/L, FT3:1.9 pmol/L); 培養(yǎng)基Ⅲ：含5 nmol/L T3的DMEM+15%低TH的FBS(TT3 4.3 nmol/L, FT3 23.2 pmol/L); 1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 無菌條件下,取生后1～2d健康SD大鼠大腦皮層,置Hanks液中清洗、剪碎、胰蛋白酶消化后,置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。于培養(yǎng)8天后用抗神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)抗體對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。按照培養(yǎng)基不同,將培養(yǎng)的細(xì)胞分為4組： 對照組：培養(yǎng)基Ⅰ×2天+培養(yǎng)基Ⅲ×6天 甲低組：培養(yǎng)基Ⅰ×2天+培養(yǎng)基Ⅱ×6天 干預(yù)組1：培養(yǎng)基Ⅰ×2天+培養(yǎng)基Ⅱ×2天+培養(yǎng)基Ⅲ×4天 干預(yù)組2：培養(yǎng)基Ⅰ×2天+培養(yǎng)基Ⅱ×4天+培養(yǎng)基Ⅲ×2天 1.3檢測指標(biāo)和方法 采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)方法繪制生長曲線。采用Takara Real time RT-PCR試劑盒對培養(yǎng)細(xì)胞的Cx43、Cx32和Cx45 mRNA進(jìn)行檢測,同時應(yīng)用Western blot方法對Cx43、Cx32和Cx45的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測,同時應(yīng)用免疫熒光染色激光共聚焦掃描對蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定位觀察。 2結(jié)果 甲低組細(xì)胞增殖緩慢,指數(shù)增長期后移,干預(yù)后細(xì)胞增殖有所改善。兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)均豐富。甲低組星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)下降,正常甲狀腺激素濃度干預(yù)后又有上升趨勢,早期干預(yù)4天其mRNA水平即能恢復(fù)到正常水平,但蛋白質(zhì)表達(dá)水平尚不能恢復(fù)到正常水平。激光共聚焦掃描顯示離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43蛋白質(zhì)表達(dá)均非常豐富,分布于胞體和樹突的胞漿內(nèi),正常組多數(shù)細(xì)胞間有熒光強(qiáng)度特別高的點狀結(jié)構(gòu),甲低組熒光強(qiáng)度較低,點狀結(jié)構(gòu)少而且熒光強(qiáng)度較低,干預(yù)組1和干預(yù)組2熒光強(qiáng)度和高熒光強(qiáng)度的點狀結(jié)構(gòu)有恢復(fù)趨勢,但干預(yù)組2高熒光強(qiáng)度的點狀結(jié)構(gòu)不均勻。 兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx32mRNA水平均較低。與對照組比較,甲低組Cx32mRNA更低,在干預(yù)后mRNA表達(dá)水平能較快上升,達(dá)到正常水平。然而,無論Western blot檢測,還是激光共聚焦掃描,均顯示各組離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx32蛋白質(zhì)表達(dá)均陰性。 兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx45表達(dá)均較豐富。甲低組Cx45表達(dá)水平明顯下降,干預(yù)后有所上升,早期干預(yù)后2-4天可恢復(fù)到正常水平。激光共聚焦掃描顯示各組離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx45蛋白表達(dá)均非常豐富,分布于胞體和樹突的胞漿內(nèi),少部分細(xì)胞間有熒光強(qiáng)度特別高的點狀結(jié)構(gòu)。 結(jié)論 1.先天性甲低可導(dǎo)致仔鼠大腦皮層總Cx43表達(dá)下降和總Cx32表達(dá)上升； 2.TH下降可導(dǎo)致離體培養(yǎng)的大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43和Cx45表達(dá)下降,GJ分布異常； 3.TH對神經(jīng)細(xì)胞Cx基因調(diào)控具有時空性； 4.短期的T3早期干預(yù),能使星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43和Cx45表達(dá)有恢復(fù)上升趨勢,但Cx43不能恢復(fù)至正常水平。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 袁哲鋒;羅燕斐;吳亦棟;沈征;趙正言;;先天性甲狀腺功能減低癥漢族兒童的促甲狀腺素受體基因失活突變[J];中華兒科雜志;2007年07期

2 楊茹萊,毛華慶,曹莉佩,周雪蓮,陳肖肖,趙正言;浙江省新生兒先天性甲狀腺功能減退癥與苯丙酮尿癥的篩查分析[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

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本文編號：2367443