【摘要】： 風(fēng)疹病毒(rubella virus,RV)是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員,是最常見、最重要的TORCH綜合征病原體之一。風(fēng)疹通常是一種輕度的兒童疾病。RV感染的危害主要在于先天性感染,孕婦在妊娠期,特別是妊娠前3個月感染RV,可引起胎兒宮內(nèi)感染,產(chǎn)生先天性風(fēng)疹綜合征,造成嬰兒全身多種器官發(fā)育畸形或功能異常,如白內(nèi)障、耳聾、先天性心臟病等,嚴(yán)重時可出現(xiàn)死胎或流產(chǎn)。 風(fēng)疹的治療至今尚無特效療法,一些抗病毒藥物臨床治療效果不佳,不能改變病程和預(yù)后,更難以預(yù)防CRS。進(jìn)行疫苗接種是目前預(yù)防風(fēng)疹和CRS最有效的手段。目前臨床應(yīng)用的疫苗均為減毒活疫苗,其中的RV可能通過胎盤感染胎兒,仍有致畸的危險性。Hofmann等證實(shí)風(fēng)疹疫苗病毒可通過胎盤與持久的胎兒感染有關(guān),故妊娠早期的婦女無法使用該疫苗預(yù)防風(fēng)疹感染,而且成年婦女接種尤其是產(chǎn)后接種后可發(fā)生一過性關(guān)節(jié)炎(10%)和關(guān)節(jié)痛(2.5%)。亞單位疫苗不含病毒核酸,只含病毒的蛋白質(zhì),故其免疫原性仍然保留,且非常安全,可供孕婦使用,但亞單位疫苗免疫效果差,不持久,需要反復(fù)注射,不易推廣使用。 若能改變RV的基因組,從而改變它的表達(dá)產(chǎn)物和生物學(xué)活性,就可以消除或降低RV的致畸性;也可以通過改變其侵入細(xì)胞或復(fù)制的特性來消除或減少胎兒感染的危險性。細(xì)胞融合是包括RV在內(nèi)的許多有膜病毒侵入細(xì)胞、復(fù)制、釋放、傳播、致病的重要生物過程,也是細(xì)胞間信息傳遞的重要步驟。有膜病毒與靶細(xì)胞膜融合后可能造成兩種后果:一是病毒的核心蛋白和遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞復(fù)制,并隨宿主細(xì)胞的分裂傳至子代細(xì)胞,造成宿主細(xì)胞死亡,健康細(xì)胞受到侵染;二是破壞靶細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,使細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境失去平衡,最終導(dǎo)致細(xì)胞病變或死亡。 因此,若能明確RV引起細(xì)胞融合的分子機(jī)制,尤其是包膜糖蛋白細(xì)胞融合活性位點(diǎn)和非活性位點(diǎn)的精確定位,可以為研制更安全有效的RV新型基因工程疫苗(基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等)和特異性抗病毒的多肽類藥物、預(yù)防和治療RV感染奠定理論基礎(chǔ)和提供技術(shù)參數(shù),還有助于RV致畸機(jī)制的研究,對包膜病毒細(xì)胞融合的分子機(jī)制的研究也有廣泛的意義。 RV 3′端結(jié)構(gòu)基因編碼的三種結(jié)構(gòu)蛋白中,衣殼蛋白C與基因組RNA結(jié)合形成核衣殼,包膜糖蛋白E2和E1是I型包膜糖蛋白,組成異二聚體而在病毒表面形成刺突結(jié)構(gòu),行使主要生物學(xué)功能。其中E2包膜糖蛋白上含有3個或4個糖基化位點(diǎn),本研究中的RV JR23株E2包膜糖蛋白上含有3個Asn-X-Ser結(jié)構(gòu)的糖基化位點(diǎn),分別位于N53、N71與N129;E1包膜糖蛋白上含有3個Asn-X-Thr結(jié)構(gòu)的糖基化位點(diǎn),分別位于N76、N177與N209。N-聯(lián)糖基化作用是真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中一個重要的蛋白翻譯后修飾過程,這種糖基化修飾在形成和維持具有生物學(xué)活性的糖基化蛋白構(gòu)象、保護(hù)蛋白多肽免受細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用與影響蛋白的抗原性和免疫原性中具有重要的作用。 為研究RV包膜糖蛋白糖基化作用對特異性細(xì)胞融合的影響,我們構(gòu)建了一系列突變體以分別去除特定位點(diǎn)的糖基化作用,觀察突變前后其引起的特異性細(xì)胞融合功能的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些位點(diǎn)糖基化作用的去除,會明顯降低特異性細(xì)胞融合活性。說明這些糖基化位點(diǎn)的糖基化作用通過形成和維持蛋白的正確構(gòu)象以保證蛋白向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn),參與了細(xì)胞融合過程。但任何一個糖基化位點(diǎn)的突變,都不能完全阻止其引起的細(xì)胞融合,而3個或3個糖基化位點(diǎn)聯(lián)合突變時,由于聯(lián)合突變體在細(xì)胞表面的表達(dá)效率顯著降低導(dǎo)致其細(xì)胞融合活性消失。說明包膜糖蛋白的不同糖基化位點(diǎn)的糖基化在特異性細(xì)胞融合中聯(lián)合起作用,也可能與其它因素在特異性細(xì)胞融合中共同起作用。 為尋找E2和E1包膜糖蛋白的細(xì)胞融合活性區(qū)域,我們選擇兩種蛋白中的特定氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變。而20種氨基酸中,亮氨酸的疏水性較強(qiáng),在蛋白結(jié)構(gòu)的形成和維持中具有重要的作用,故在E2與E1包膜糖蛋白中行使主要生物學(xué)功能的胞外區(qū)域,分別選擇保守性的亮氨酸位點(diǎn)進(jìn)行突變,觀察突變前后其引起特異性細(xì)胞融合功能的變化,以初步探討其引起細(xì)胞融合的分子機(jī)制。 一、RV包膜糖蛋白糖基化作用對細(xì)胞融合的影響 本研究采用體內(nèi)同源重組的方法,構(gòu)建六個突變體,每個突變體改變一個相應(yīng)的糖基化位點(diǎn)以阻斷該位點(diǎn)的糖基化作用。其中突變體N53G、S73I和S131V分別去除了E2包膜糖蛋白第53位、71位或129位的天冬酰胺的糖基化作用,T78A、T179A和T211A則分別去除了E1包膜糖蛋白第76位、177位或209位天冬酰胺的糖基化作用。 FACS分析表明,除S131V之外,其它突變體蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)效率均有不同程度的降低。 含有不同突變位點(diǎn)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞融合。通過除以相應(yīng)蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)率對其細(xì)胞融合率進(jìn)行了校正。與野毒株相比,校正后突變體N53G、S73I、S131V、T78A、T179A與T211A的細(xì)胞融合率分別為62.73%、66.66%、55.12%、66.93%、87.33%與90.18%。這說明E2蛋白的3個糖基化位點(diǎn)與E1蛋白的糖基化位點(diǎn)N76在RV引起的細(xì)胞融合中具有重要的作用,而E1蛋白的糖基化位點(diǎn)N177與N209對RV引起的細(xì)胞融合影響較小。 含有不同突變位點(diǎn)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,均可出現(xiàn)血吸附,與野毒株比較,除S73I與T78A突變體蛋白的血吸附效率略有降低之外,其它突變體蛋白的血吸附效率保持不變。 本研究中還構(gòu)建了一系列糖基化位點(diǎn)的聯(lián)合突變體,分別為N53G-S73I、N53G-S131V、S73I-S131V、N53G-S73I-S131V、T78A-T179A、T78A-T211A、T179A-T211A、T78A-T179A-T211A、N53G-T78A、N53G-T179A與N53G-T211A。 FACS檢測發(fā)現(xiàn),與野毒株相比,除N53G-T78A(25.30%)與N53G-T211A(21.91%)之外,其它聯(lián)合突變體在細(xì)胞表面的表達(dá)效率均低于20%。Giemsa染色在所有聯(lián)合突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中均檢測不到細(xì)胞融合。而血吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),除N53G-S131V、N53G-T78A與N53G-T211A轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能吸附少量的鴿紅細(xì)胞外,其它聯(lián)合突變體中均檢測不到血吸附。 二、E2包膜糖蛋白亮氨酸突變對特異性細(xì)胞融合的影響 采用體內(nèi)同源重組的方法,分別得到突變體E2 L14A、L35A、L58A、L105A、L128A、L144A、L178A、L183A、L225A。其中L14、L58、L128、L178、L225位于E2蛋白的coil結(jié)構(gòu)中,L35、L105、L144、L183位于E2蛋白的strand結(jié)構(gòu)中。 FACS分析表明,與野毒株相比,除L144A與L225A之外,其它突變體蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)效率均有不同程度的降低。 含有不同突變位點(diǎn)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞融合。通過除以相應(yīng)蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)率對其細(xì)胞融合率進(jìn)行了校正。與野毒株相比,突變體L14A、L35A、L58A、L105A、L128A、L144A、L178A、L183A與L225A的細(xì)胞融合率分別為88.31%、79.55%、41.79%、49.16%、54.34%、49.56%、72.31%、82.09%與69.09%。即各突變體蛋白引起特異性細(xì)胞融合的效率均有不同程度的降低。 含有不同突變位點(diǎn)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,均可出現(xiàn)血吸附,與野毒株比較,L58A、L105A、L128A與L144A突變體蛋白的血吸附效率有所降低,其它突變體蛋白的血吸附效率不變。 三、E1包膜糖蛋白亮氨酸突變對特異性細(xì)胞融合的影響 采用體內(nèi)同源重組的方法,分別構(gòu)建突變體E1 L23A、L62A、L98A、L169A、L192A、L255A、L265A、L322A、L334A、L370A與L391A。其中L62、L265、L322、L334、L391位于E1蛋白的coil結(jié)構(gòu)中,L23、L98、L169、L192、L255、L370位于E1蛋白的strand結(jié)構(gòu)中。突變時分別將相應(yīng)的亮氨酸突變?yōu)楸彼帷?FACS分析表明,與野毒株相比,除L192A、L334A、L370A與L391A之外,其它突變體蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)效率均有不同程度的降低。值得注意的是,L370A突變體蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)效率略高于野毒株在細(xì)胞表面的表達(dá)效率。 含有不同突變位點(diǎn)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞融合。通過除以相應(yīng)蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)率對其細(xì)胞融合率進(jìn)行了校正。與野毒株相比,突變體L23A、L62A、L98A、L169A、L192A、L255A、L265A、L322A、L334A、L370A與L391A的細(xì)胞融合率分別為60.89%、73.28%、86.41%、84.21%、91.62%、87.00%、48.96%、74.88%、93.38%、80.25%與73.64%。即各突變體蛋白引起特異性細(xì)胞融合的效率均有不同程度的降低。 含有不同突變位點(diǎn)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,均可出現(xiàn)血吸附,與野毒株比較,除L98A、L169A與L391A外,其他突變體蛋白的血吸附效率均有不同程度的降低。 從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出的結(jié)論: E2蛋白的3個糖基化位點(diǎn)和E1蛋白的N76在RV引起的細(xì)胞融合中均有重要作用,其中S73I與T78A對敏感細(xì)胞的吸附能力略有降低,這也是其影響細(xì)胞融合的原因之一。同一個糖基化位點(diǎn)的糖基化作用在蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)與其引起的細(xì)胞融合中具有不同的重要性,其中E2蛋白的N71與E1蛋白的N177對其在細(xì)胞表面的表達(dá)具有更重要的作用。2個或3個糖基化位點(diǎn)同時突變時,由于其在細(xì)胞表面表達(dá)效率顯著降低而使細(xì)胞融合現(xiàn)象消失。 E2蛋白二級結(jié)構(gòu)中的coil結(jié)構(gòu)對蛋白向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)及在細(xì)胞表面的正確表達(dá)有重要的作用。而在E2蛋白中行使主要生物學(xué)功能的胞外區(qū)部分,其氨基酸序列中間靠近氨基端的蛋白區(qū)域(L58～L144)對引起的特異性細(xì)胞融合具有重要的作用。 E1包膜糖蛋白各突變體引起的細(xì)胞表面表達(dá)效率的變化和細(xì)胞融合效率的變化具有一定的一致性,說明這些亮氨酸的突變同時影響到蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)和引起細(xì)胞融合的功能,影響的程度則取決于亮氨酸在E1蛋白中所處的位置。其氨基端的蛋白區(qū)域和氨基酸序列中間靠近羧基端部分(L265及附近)的蛋白區(qū)域?qū)σ鸬奶禺愋约?xì)胞融合具有重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2365949