本文選題：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 + 慢病毒表達(dá)載體　； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的構(gòu)建攜帶ACE2基因的慢病毒表達(dá)載體,觀察其感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后ACE2表達(dá)增加對AngⅡ誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性降低與凋亡增加的影響,初步探討該影響的機(jī)制。 方法1.采用PCR技術(shù)從含有ACE2基因的質(zhì)�？寺∧０錺c-DNA3.1-hygro(+)-mACE2上釣取ACE2基因,并將ACE2基因重組到慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒pGC-FU中,構(gòu)建重組慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒pGC-FU-ACE2,通過酶切、測序驗證ACE2基因后,將pGC-FU-ACE2質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pHelper1.0,pHelper2.0共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞,獲得攜帶ACE2基因的重組慢病毒(Lentiviral-ACE2)。2.以感染復(fù)數(shù)為10(MOI=10)感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,感染72小時后通過RT-PCR,Western-blot檢測各組細(xì)胞ACE2基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平3. Lentiviral-ACE2感染原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后給予AngⅡ(終濃度10-7mol/L)處理,隨機(jī)分為正常細(xì)胞組、AngⅡ組、AngⅡ+Lentiviral-GFP組和AngⅡ+Lentiviral-ACE2組,通過倒置相差顯微鏡觀察各組HUVEC的形態(tài)學(xué)變化,AlamarBlue試劑檢測各組HUVEC增殖功能,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測各組HUVEC的凋亡,初步探討ACE2發(fā)揮上述作用的機(jī)制。 結(jié)果1.成功構(gòu)建攜帶ACE2基因的慢病毒表達(dá)載體(Lentiviral-ACE2),并獲得大量高純度的慢病毒濃縮液2.目的基因ACE2能被重組慢病毒高效地導(dǎo)入人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,并能高水平表達(dá)。3. AngⅡ組與AngⅡ+Lentiviral-GFP組細(xì)胞生長狀態(tài)差,生長緩慢,形態(tài)不規(guī)則并且有不同程度脫壁懸浮的細(xì)胞;而正常細(xì)胞對照組與AngⅡ+Lentiviral-ACE2組細(xì)胞生長狀態(tài)良好,圓形、卵圓形,飽滿,形態(tài)正常呈“鋪路石”樣生長,緊密貼壁,懸浮細(xì)胞少;AngⅡ組AlamarBlue被還原率較正常細(xì)胞組明顯降低(P0.05),AngⅡ+ Lentiviral-ACE2組較AngⅡ組AlamarBlue被還原率顯著增高(P0.05);AngⅡ組的凋亡指數(shù)(0.1165±0.0181)與正常細(xì)胞對照組凋亡指數(shù)(0.0373±0.0113)相比具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),同時與AngⅡ+Lentiviral-ACE2組凋亡指數(shù)(0.0540±0.0061)相比,也具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。AngⅡ組與AngⅡ+Lentiviral-GFP相比、正常細(xì)胞對照組與AngⅡ+Lentiviral-ACE2組相比的AlamarBlue被還原率和凋亡指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論慢病毒表達(dá)載體Lentiviral-ACE2成功構(gòu)建并能高效率感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;AngⅡ具有促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力下降和凋亡增加的作用,ACE2表達(dá)增加能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性降低和凋亡增加,對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。
[Abstract]:Objective to construct a lentivirus expression vector carrying ACE2 gene, and to observe the effect of increased ACE2 expression on the decrease of proliferation activity and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by Ang 鈪，

本文編號：1930126