本文選題：基因治療 + 第一代腺病毒載體�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 研究背景及目的: 基因治療是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一,近年來作為基礎(chǔ)的病毒載體的研究有了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在體內(nèi)不整合入宿主細(xì)胞染色體等優(yōu)點(diǎn),已被認(rèn)為是最為有效的轉(zhuǎn)基因載體之一,并廣泛運(yùn)用于人類基因治療。 但是,宿主的免疫反應(yīng)仍然是獲得轉(zhuǎn)基因長期表達(dá)和重復(fù)使用腺病毒載體的主要障礙。到目前為止,腺病毒載體共有三代載體。第一代腺病毒載體中,E1/E3基因表達(dá)盒已經(jīng)去除了,但E1區(qū)表達(dá)的缺失不利于載體的轉(zhuǎn)錄表達(dá),主要是由于受到了針對病毒包殼和轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng),而使基因表達(dá)受到抑制。為抑制發(fā)生的免疫反應(yīng),提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,之后構(gòu)建的腺病毒載體中去除了部分或全部的E2基因,造成病毒基因的缺失或突變,減弱病毒蛋白的表達(dá),并且加入可以調(diào)控基因表達(dá)的溫敏因子,消除了復(fù)制DNA和產(chǎn)生可復(fù)制腺病毒(載體)(Replication Competent Adenovirus, RCA)的可能性,也就是所謂的第二代腺病毒載體。更為“復(fù)雜”的腺病毒載體就是第三代腺病毒載體,在其構(gòu)建時去除了某些病毒基因,甚至是去除了全部的病毒基因;既所謂的“空殼”載體起先只保留了反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeats, ITR)和包裝信號,且在產(chǎn)生中需要輔助病毒和合適的互補(bǔ)包裝細(xì)胞,更需要進(jìn)一步的純化,常稱為輔助病毒依賴型腺病毒或空殼腺病毒或具有高包裝能力的腺病毒(high-capacity or gutted or helper-dependent Adenovirus vectors, HD-AdV)。 腺病毒載體引起機(jī)體免疫反應(yīng)的主要有:固有免疫和獲得性免疫。腺病毒載體進(jìn)入機(jī)體首先啟動的是固有免疫系統(tǒng),固有免疫反應(yīng)主要是嗜中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等的激活并吞噬進(jìn)入機(jī)體的病毒載體及轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物。在這些細(xì)胞激活后會分泌一些細(xì)胞因子,其中IL-2、IL-6和TNF-a由單核巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生,對急性炎癥反應(yīng)和免疫增強(qiáng)都有非常重要的作用。獲得性免疫又分為細(xì)胞免疫和體液免疫,細(xì)胞免疫反應(yīng)主要是機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocytes, CTL)特異性殺傷和消除轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。體液免疫則通過機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體來消除腺病毒載體和轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物。 IL-2,IL-6和TNF-a等細(xì)胞因子是固有免疫和急性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子,也在適應(yīng)性免疫中起到了重要作用。另外,細(xì)胞免疫中目前已知T細(xì)胞被激活和增殖至少需要兩個信號,第一信號是活化T細(xì)胞的必需條件,但要使之對病毒或轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物抗原的特異性CTL增殖并獲得全部效應(yīng)功能,尚需要第二信號,即共刺激分子與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體間的相互作用。能夠傳遞第二信號的共刺激分子主要包括B7分子家族、細(xì)胞黏附分子和LFA-3等,其中B7-1(CD80)與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合能誘導(dǎo)IL-2等淋巴因子的分泌,是決定第一信號能否產(chǎn)生T細(xì)胞功能性激活的關(guān)鍵因素。 本課題擬用SPF級飼養(yǎng)的SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物,通過蛛網(wǎng)膜下腔和腹腔兩種注射途徑,比較第一代腺病毒載體和第三代腺病毒載體注射后不同時間點(diǎn)免疫反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的變化。用ELISA法檢測不同時間點(diǎn)大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的含量和血清中免疫球蛋白IgG的含量;流式細(xì)胞儀檢測病毒注射后不同時間點(diǎn)脾臟細(xì)胞共刺激分子CD80表達(dá)變化;另外用HE染色的方法觀察病毒腹腔注射后肺組織炎癥浸潤情況。通過以上方法來分析比較兩種腺病毒載體的免疫反應(yīng)差異。 方法: 1、IL-2、IL-6、TNF-a等細(xì)胞因子的檢測:動物實(shí)驗(yàn)分組,SD大鼠共分兩大組:蛛網(wǎng)膜下腔注射組和腹腔注射組,其中每組再分為第一代腺病毒載體注射組、第三代腺病毒載體注射組、對照組(生理鹽水注射組)。分別于不同時間點(diǎn)(注射前當(dāng)天T0,注射后1天T1,注射后3天T2,注射后7天T3,注射后14天T4)采眼眶后靜脈血,1000r/min離心20min取上清-20℃保存。用ELISA法檢測血清中IL-2、IL-6、TNF-a等的含量。 2、共刺激分子B7-1(CD80)的檢測:動物實(shí)驗(yàn)分組,SD大鼠共分兩大組:蛛網(wǎng)膜下腔注射組和腹腔注射組,其中每組再分第一代腺病毒載體注射組、第三代腺病毒載體注射組、對照組(生理鹽水注射組)。分別于不同時間點(diǎn)(注射前當(dāng)天T0,注射后1天T1,注射后3天T2,注射后7天T3,注射后14天T4),麻醉后處死SD大鼠,取大鼠脾臟研磨成細(xì)胞懸液后用流式細(xì)胞儀檢測脾臟細(xì)胞CD80分子表達(dá)情況,CD80分子一抗用PE標(biāo)記。 3、大鼠IgG的測定:動物實(shí)驗(yàn)分組同上,分別于不同時間點(diǎn)(注射前當(dāng)天T0,注射后1天T1,注射后3天T2,注射后7天T3,注射后14天T4),取眼眶后靜脈血1000r/min離心20min取上清-20℃保存。用ELISA測定血清中IgG含量。 4、HE染色檢測肺部組織炎癥浸潤情況:病毒腹腔注射后,第一代腺病毒載體注射組、第三代腺病毒載體注射組、對照組(生理鹽水注射組)。分別于不同時間點(diǎn)(注射前當(dāng)天T0,注射后1天T1,注射后3天T2,注射后7天T3,注射后14天T4),麻醉后處死SD大鼠,取肺組織,多聚甲醛固定保存,檢測。 結(jié)果: 1.注射前(T0),各組指標(biāo)無顯著差異。 2.固有免疫反應(yīng)檢測結(jié)果:病毒載體經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔和腹腔注射SD大鼠后,同時間點(diǎn)血清中IL-6、TNF-a等因子分泌水平,第一代腺病毒載體注射組均高于第三代腺病毒載體注射組,而且兩組均高于對照組。 3.細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測結(jié)果:病毒載體經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔和腹腔注射SD大鼠后,3天和7天脾臟中共刺激分子CD80的表達(dá)第一代腺病毒載體注射組均高于第三代腺病毒載體注射組,而且兩組均高于對照組;同時間點(diǎn)血清中IL-2分泌水平,第一代注射組高于第三代注射組,而且兩組均高于對照組。 4.體液免疫反應(yīng)檢測結(jié)果:病毒載體經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔和腹腔注射SD大鼠后,同時間點(diǎn)血清IgG的含量,第一代腺病毒載體注射組高于第三代腺病毒載體注射組,而且兩組均高于對照組。 5.兩代病毒載體經(jīng)腹腔注射SD大鼠后,肺組織HE染色顯示各組間無顯著差異。 結(jié)論: 成功的用動物實(shí)驗(yàn)的方法比較了兩種腺病毒載體的免疫反應(yīng)。固有免疫反應(yīng)指標(biāo),檢測了病毒注射后血清中IL-6、TNF-a等因子分泌水平;細(xì)胞免疫反應(yīng)指標(biāo),檢測了病毒注射后血清中IL-2分泌水平和脾臟細(xì)胞CD80表達(dá)情況;體液免疫反應(yīng),檢測了病毒注射后血清中IgG的含量。通過不同免疫反應(yīng)階段的檢測得出結(jié)論:第三代腺病毒載體的免疫反應(yīng)低于第一代腺病毒載體,說明了第三代腺病毒載體由于其較弱的免疫反應(yīng),更適用于基因治療,同時也為基因治療開拓了更為廣闊的前景。 但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出第三代腺病毒載體還是能夠引起一定的免疫反應(yīng),為我們的研究工作提出了新的問題,這就要求我們在以后的科研工作中要尋求方法進(jìn)一步完善腺病毒載體,爭取將其免疫反應(yīng)降到最低。
[Abstract]:Background and purpose of the study :



Gene therapy is one of the hot topics at home and abroad . Recently , the research of viral vectors based on adenovirus vectors has made great progress in recent years . The high efficiency , low pathogenicity , high titer and non - integration of adenovirus vectors into host cell chromosomes have been considered to be one of the most effective transgenic vectors and widely used in human gene therapy .



In the first generation adenovirus vector , the E1 / E3 gene expression cassette has been removed , but the deletion of the E1 region is not beneficial to the expression of the vector .



The immune response of human body is caused by the adenovirus vector : the innate immunity and the acquired immunity . The adenovirus vector enters the organism first to activate the innate immune system . The innate immune response is mainly the activation of neutrophils , mononuclear phagocytes , NK cells and the like , and phagocyters the viral vectors and the transduced products into the organism . The acquired immunity is divided into cellular immunity and humoral immunity , and the cellular immune response is mainly the cytotoxic T lymphocytes ( CTL ) specific killing and elimination of the transduced target cells . The humoral immunity is used to generate specific antibodies to eliminate the adenovirus vectors and the transduced products .



IL - 2 , IL - 6 and TNF - a are the key factors of innate immunity and acute inflammatory response , and play an important role in adaptive immunity .



The levels of IL - 2 , IL - 6 and TNF - 偽 in serum of rats with different time points were compared by ELISA . The expressions of IL - 2 , IL - 6 and TNF - 偽 were detected by ELISA .



Method :



1 銆，

本文編號：1744709