[背景和目的]：線粒體是真核細胞內(nèi)重要的細胞器，其主要功能包括通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，也參與細胞內(nèi)其它生命活動的信號轉(zhuǎn)導過程。線粒體擁有自身的遺傳物質(zhì)－線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)。mtDNA中有13個多肽編碼基因存在，可編碼13個相關功能蛋白，這些蛋白可參與合成線粒體呼吸鏈酶復合物。mtDNA中還包括了可編碼22個tRNA以及2個rRNA的基因。mtDNA的轉(zhuǎn)錄、復制還可能受線粒體microRNA(MitomiRS)的調(diào)控，MitomiRS表達變化可能導致線粒體結(jié)構(gòu)及功能的改變。 MicroRNAs(microRNAs)長約22至25nt，由核基因組編碼，microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對構(gòu)成基因沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯而發(fā)揮作用。microRNAs在特定的組織（特異性）及特定的發(fā)育階段（時序性）表達，導致了其在生物體功能中起到的特殊性作用，如microRNA進入線粒體后可能會調(diào)節(jié)mtDNA的表達，而mtDNA的延緩性損害可以延緩細胞衰老的過程，因此這也提示了microRNA在調(diào)控細胞以及組織生長發(fā)育發(fā)展過程中有著不可替代的作用。 多核苷酸磷酸化酶(Polynucleotide Phosphorylase，PNPase)存在于線粒體膜間隙(intermembrane space，，IMS)，是一種高度保守的3’—5’核糖核酸外切酶，依靠磷酸化作用降解RNA。此外，PNPase介導細胞核編碼的microRNA輸入線粒體。因此推測：調(diào)控PNPase可能導致MitomiRS表達譜變化，進而引起線粒體結(jié)構(gòu)及功能的變化。 本研究旨在：①通過shRNA技術(shù)下調(diào)腫瘤細胞PNPase表達，檢測線粒體microRNA(MitomiRs)表達譜的變化。②MitomiRs變化對線粒體DNA損傷的影響。③采用生物信息學預測差異表達的MitomiRs的功能。 [實驗方法] 1、構(gòu)建PNPase shRNA慢病毒載體、細胞轉(zhuǎn)染。選取人肝癌細胞SK-Hep1、HepG2及人骨肉瘤細胞U2OS三種細胞系，將構(gòu)建好的帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到目的細胞中，采用熒光顯微鏡觀測和western-blot方法檢測PNPase shRNA效果。 2、 MitomiRs芯片檢測：抽提目的細胞線粒體，再提出線粒體RNA，采用miRNA芯片篩選抑制PNPase表達前后細胞中差異表達的MitomiRs,以信號值3、2倍法(foldchange=2)作為MitomiRs差異篩選標準，GeneSpring GX軟件分析microRNA芯片得到的數(shù)據(jù)。采用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detectingsystem,Q-PCR)檢測線粒體DNA(mitochondril DNA, mtDNA)的損傷頻率；采用酶聯(lián)免疫吸附方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測線粒體氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)的變化情況。 3、生物信息學預測：在TargetScan、miRanda、PicTar、MirTarget2、PITA五個生物功能信息數(shù)據(jù)庫中同時對差異表達的MitomiRs對應的靶基因進行預測；同時在三個或三個以上數(shù)據(jù)庫中具有生物學意義的MitomiRs靶基因納入后續(xù)功能分析；利用DAVID功能注釋基因芯片生物信息學分析軟件(DAVID Functional AnnotationBioinformatics Microarray Analysis)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)預測線粒體相關MitomiRs靶基因(GO分析)，以及與這些MitomiRs相關的信號通路(Pathway分析)。 [實驗結(jié)果] 1、采用分子克隆技術(shù)成功地構(gòu)建了PNPase shRNA慢病毒表達載體，并轉(zhuǎn)染人肝細胞癌細胞SK-Hep1、Hep G2以及人骨肉瘤細胞U2OS。 2、SK-Hep1、HepG2和U2OS細胞轉(zhuǎn)染空載體病毒及PNPase shRNA慢病毒12～24小時后可見明顯的綠色熒光。當MOI(轉(zhuǎn)染復數(shù))=20時，3種細胞的慢病毒轉(zhuǎn)染效率達到80％以上。連續(xù)觀察1～2周，轉(zhuǎn)染效率仍維持在70％~80％。 3、轉(zhuǎn)染PNPase shRNA慢病毒細胞PNPase表達顯著低于空白對照組及陰性對照組(p0.05)，而空白對照組和陰性對照組PNPase表達無顯著差異(p0.05)。 4、SK-Hep1-shPNPase、Hep G2-shPNPase、U2OS-shPNPase組細胞線粒體DNA的損傷頻率較空白對照組及陰性對照組顯著減少(P0.05)。 5、SK-Hep1-shPNPase、Hep G2-shPNPase、U2OS-shPNPase組細胞氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG的檢測量明顯低于空白對照組和陰性對照組(P0.05)。 6、MicroRNA芯片差異篩選結(jié)果顯示(信號值≥3,foldchange≥2)：在SK-Hep1、Hep G2及U2OS三種細胞系中， sh-PNPase組細胞表達下調(diào)的MitomiRs有hsa-miR-3934-5p、 hsa-miR-5010-3p、 hsa-miR-3154等16個，表達上調(diào)的MitomiRs有hsa-miR-1973、hsa-miR-503-5p、hsa-miR-5010-3p等31個。通過TargetScan等五個靶基因數(shù)據(jù)庫的同時預測，發(fā)現(xiàn)這些差異表達的MitomiRs，如mir-3154、mir-34a-3p、mir-4312、mir-98-3p等涉及的靶基因主要有： CASP(apoptosis-related cysteine peptidase)、CARD(caspase recruitment domain family)、 CAAP(caspase activity and apoptosisinhibitor)、AVEN(apoptosis, caspase activation inhibitor)、Fas、FADD(Fas-associated viadeath domain)等。主要的靶基因功能包括：DNA損傷反應、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、抗凋亡調(diào)節(jié)、膜穩(wěn)定性等。主要涉及的信號通路有：細胞凋亡、ErbB信號通路、MAPK信號通路等。這些靶基因可通過Fas—FADD—CASP/CARD/CAAP/AVEN—Mitochondria路徑來保護mtDNA和影響線粒體功能。 [結(jié)論] 抑制細胞PNPase的表達可引起MitomiRs表達譜發(fā)生顯著變化；MitomiRs表達變化可能影響線粒體DNA氧化損傷。因此，PNPase可能通過調(diào)控MitomiRs參與了線粒體DNA氧化損傷的調(diào)節(jié)。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416

【參考文獻】

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1 文蕾;凌賢龍;周源;;端粒酶線粒體轉(zhuǎn)位與肝癌細胞多藥耐藥的相關性研究[J];腫瘤;2012年01期

本文編號：1206253