本文關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激顆粒機(jī)制的初步探討

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【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是黃病毒科黃病毒屬成員,為單正鏈RNA病毒。病毒基因組編碼單一開(kāi)放閱讀框,其蛋白多肽前體經(jīng)切割形成結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白。且非結(jié)構(gòu)蛋白于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成復(fù)制復(fù)合體,為HCV復(fù)制提供場(chǎng)所。HCV極易形成持續(xù)性感染,是威脅人類(lèi)健康的重要病原體。 已有文獻(xiàn)報(bào)道HCV感染細(xì)胞后,可使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激顆粒。應(yīng)激顆粒(Stress Granule, SG)是細(xì)胞在接受包括氧化物,病毒感染等一定程度的外界刺激后而產(chǎn)生的致密顆粒狀聚合體,由真核翻譯起始復(fù)合物,RNA結(jié)合蛋白以及停止翻譯的mRNA等成分組裝成,是細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下重要的調(diào)節(jié)元件。到目前為止,HCV誘生細(xì)胞應(yīng)激顆粒的機(jī)制未明,且應(yīng)激顆粒對(duì)HCV持續(xù)性感染是否存在影響未知,本研究擬探討HCV對(duì)細(xì)胞應(yīng)激顆粒是否存在調(diào)節(jié)作用,并應(yīng)激顆粒的產(chǎn)生對(duì)HCV形成持續(xù)性感染是否發(fā)揮作用。 本研究首先對(duì)HCV感染誘生的應(yīng)激顆粒的組成及性質(zhì)進(jìn)行了研究。利用免疫熒光染色,明確了HCV (JC1)感染Huh7細(xì)胞后所形成的應(yīng)急顆粒包含四種應(yīng)激顆粒關(guān)鍵成分,即翻譯相關(guān)蛋白eIF4G,eIF3A以及RNA結(jié)合蛋白G3BP1,TIA-1,故為完整的應(yīng)激顆粒。同時(shí)發(fā)現(xiàn),HCV感染Huh7細(xì)胞誘生的應(yīng)激顆粒能夠被氧應(yīng)激型應(yīng)激顆粒抑制劑放線(xiàn)菌酮(CHX)有效抑制,確認(rèn)HCV誘生的應(yīng)激顆粒典型應(yīng)激顆粒。 在確認(rèn)HCV能夠誘生典型應(yīng)激顆粒的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)HCV感染Huh7細(xì)胞后8小時(shí)應(yīng)激顆粒陽(yáng)性細(xì)胞的比例為3%：12小時(shí)內(nèi),應(yīng)激顆粒陽(yáng)性細(xì)胞比例上升至8%,在24小時(shí)達(dá)到峰值13.4%,48小時(shí)后回落至10%,72小時(shí)又升至13%左右,則表明HCV感染誘生的低水平應(yīng)激顆粒,并存在波動(dòng)。同時(shí)觀察到,相較于包括SFV、MHV等病毒在內(nèi)的多種RNA病毒在感染早期能夠使35%以上的被感染細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激顆粒,HCV在早期感染建立(即0-12小時(shí)內(nèi))時(shí)期僅誘生少量應(yīng)激顆粒(約8%)。進(jìn)而研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)激顆粒誘導(dǎo)劑(亞砷酸鈉,NaAsO2)的刺激下,Huh7細(xì)胞感染HCVcc病毒8小時(shí)與不感染相比,誘生應(yīng)激顆粒陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著下調(diào)了42%,提示HCV在感染早期具備抑制細(xì)胞誘生應(yīng)激顆粒的能力。 以往研究表明病毒蛋白或核酸具備抑制應(yīng)激顆粒形成能力,推測(cè)HCV早期感染翻譯出的病毒蛋白有可能通過(guò)某種機(jī)制抑制應(yīng)激顆粒形成。于是進(jìn)一步探討HCV五種主要病毒蛋白(core、NS3/4A、NS4B, NS5A、NS5B等)對(duì)細(xì)胞應(yīng)激顆粒誘生水平的影響,發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)的情況下,僅HCV RNA多聚酶NS5B能夠抑制亞砷酸鈉誘導(dǎo)產(chǎn)生的應(yīng)激顆粒(降低約40%),并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),在表達(dá)NS5B并未能誘生應(yīng)激顆粒的細(xì)胞中,應(yīng)激顆粒組成分子G3BP1與NS5B呈部分共定位。同時(shí)NS5B的抑制功能及與G3BP1的共定位在HepaG2源的tet-on-NS5B誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系統(tǒng)中得以驗(yàn)證(降低約42%)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí),NS5B過(guò)表達(dá)不影響亞砷酸鈉誘導(dǎo)PKR激活以及e IF2α磷酸化的水平,表明NS5B抑制應(yīng)激顆粒的形成發(fā)生在e IF2α磷酸化的下游,即應(yīng)激顆粒裝配期,提示NS5B的抑制作用靶點(diǎn)為應(yīng)激顆粒組成成分。綜上所述,NS5B抑制應(yīng)激顆�？赡馨l(fā)生在裝配期,并與G3BP1共定位,同時(shí)本室前期曾報(bào)道G3BP1與NS5B存在相互作,提示NS5B可能通過(guò)直接與G3BP1相互作用以抑制應(yīng)激顆粒。 為進(jìn)一步確證NS5B是如何通過(guò)與G3BP1相互作用干擾應(yīng)激顆粒形成,首先明確NS5B負(fù)責(zé)結(jié)合G3BP1的作用區(qū)段。構(gòu)建了G3BP1-GST融合蛋白以及NS5B三段主要截短突變體,利用GST pull-down實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了NS5B中間手掌結(jié)構(gòu)段(96-454aa)負(fù)責(zé)與G3BP相互作用；進(jìn)而在Huh7細(xì)胞過(guò)表達(dá)NS5B全長(zhǎng)及其三段截短體,并用誘導(dǎo)劑誘生應(yīng)激顆粒,發(fā)現(xiàn)僅過(guò)表達(dá)G3BP1的結(jié)合區(qū)段(NS5B,96-454aa)與NS5B全長(zhǎng)能夠抑制應(yīng)激顆粒的產(chǎn)生(NS5B,96-454aa下降35%；NS5B全長(zhǎng)下降38%)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NS5B通過(guò)其中間手掌結(jié)構(gòu)段(96-454aa)與G3BP1相互作用而干擾應(yīng)激顆粒的形成。 研究表明在持續(xù)刺激下,應(yīng)激顆粒中的細(xì)胞mRNA會(huì)進(jìn)入降解途徑使細(xì)胞受損,同時(shí)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)HCV誘生的應(yīng)激顆粒中大量包含有ISG基因mRNA而導(dǎo)致ISG蛋白表達(dá)水平下降,推測(cè)NS5B影響G3BP1抑制應(yīng)激顆粒的生理學(xué)意義可能存在兩種解釋?zhuān)阂环矫娣乐惯^(guò)量誘生應(yīng)激顆粒造成細(xì)胞必需蛋白供應(yīng)不足而受損以致影響感染建立,另一方面則通過(guò)上調(diào)干擾素刺激基因(ISG)的表達(dá)以幫助病毒維持低水平復(fù)制從而導(dǎo)致慢性化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NS5B不影響應(yīng)激顆粒對(duì)管家基因β-actin的翻譯抑制。進(jìn)一步通過(guò)過(guò)表達(dá)NS5B,干擾素及刺激劑處理等條件模擬HCV感染后病毒蛋白表達(dá),誘生干擾素刺激基因(ISG)蛋白表達(dá)與應(yīng)激顆粒的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NS5B全長(zhǎng)及手掌結(jié)構(gòu)段分別顯著上調(diào)應(yīng)激顆粒對(duì)ISG分子ISG20, APOBEC3G翻譯抑制(全長(zhǎng)：ISG20,上調(diào)141%；APOBEC3G,上調(diào)172%.手掌結(jié)構(gòu)段：ISG20,上調(diào)112%；APOBEC3G,上調(diào)134%)。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)HCV RNA多聚酶NS5B通過(guò)其手掌結(jié)構(gòu)(96-454aa)與應(yīng)激顆粒關(guān)鍵組成蛋白G3BP1相互作用,干擾G3BP1參與細(xì)胞應(yīng)激顆粒的裝配,從而抑制HCV感染早期的12小時(shí)內(nèi)細(xì)胞應(yīng)激顆粒的形成。這一結(jié)果提示HCV可能通過(guò)NS5B抑制應(yīng)激顆粒,回復(fù)某些干擾素刺激基因編碼蛋白的表達(dá),以負(fù)反饋途徑維持HCV低水平感染,這對(duì)于HCV持續(xù)性感染提供了一種可能的解釋,為進(jìn)一步深入研究闡HCV與宿主細(xì)胞間關(guān)系提供了一定提示。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎 非結(jié)構(gòu)蛋白5B Ras GTP酶活化蛋白結(jié)合蛋白1(G3BP1) 應(yīng)激顆粒 抑制形成
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R373.21
【目錄】：

• 目錄3-4
• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-13
• 材料與方法13-33
• 結(jié)果33-59
• 討論59-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 綜述68-79
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 附錄79-80
• 一.在學(xué)期間學(xué)術(shù)交流情況79
• 二.論文發(fā)表情況79
• 三.獲獎(jiǎng)情況79
• 四.教學(xué)工作情況79-80
• 致謝80-81

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本文編號(hào)：1106725