發(fā)布時間：2017-10-06 11:01

  本文關(guān)鍵詞：帕金森病中TREM2的基因多態(tài)性及其在MPTP小鼠中的表達(dá)研究

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【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種中老年人常見的神經(jīng)退行性疾病,以中腦黑質(zhì)多巴胺(Dopamine, DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失和α-突觸核蛋白(a-synuclein, a-syn)沉積、路易小體(Lewy body, LB)形成為主要病理特征。當(dāng)PD進(jìn)展到晚期時,其運(yùn)動癥狀及癡呆、抑郁等非運(yùn)動癥狀可導(dǎo)致患者殘疾,嚴(yán)重降低PD患者的生活質(zhì)量,給照料者和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前,PD的藥物治療僅為癥狀性治療,尚無充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明任何一種抗PD藥物有確切的神經(jīng)保護(hù)作用或延緩疾病進(jìn)展作用。目前,PD確切的發(fā)病機(jī)制尚未清楚。既往,PD被認(rèn)為是散發(fā)性的疾病,隨著家族性PD中多個致病基因和易感基因的發(fā)現(xiàn),目前認(rèn)為PD是遺傳因素、環(huán)境因素和老齡化共同導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。近20年來,SNCA (a-synuclein)基因、LRRK2 (Leucine-rich repeat kinase 2)基因、GBA (Glucocerebrosidase)基因、parkin基因、PINK1 (PTEN induced putative kinase 1)基因及DJ-1基因等多個致病基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。但所有單基因突變導(dǎo)致的家族性PD患者占所有PD患者的比例小于5%,這提示,對于占大多數(shù)的散發(fā)性PD,有其他的遺傳因素影響了疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來,一些大型的全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome Wide Association Study, GWAS)發(fā)現(xiàn)了多個基因的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)與散發(fā)性PD易感性存在關(guān)聯(lián)。SNCA基因、GBA基因、MAPT (Microtubule associated protein tau)基因、LRRK2基因及RIT2 (Ras-like without CAAX 2)基因等的SNP位點(diǎn)已被多項(xiàng)GWAS研究證實(shí)與散發(fā)性PD的易感性相關(guān)。這些易感基因特定位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性與PD發(fā)病并非確切的因果關(guān)系,但可通過影響相應(yīng)蛋白的編碼或轉(zhuǎn)錄后修飾等影響蛋白的生物學(xué)功能,從而影響散發(fā)性PD的易感性,因此,尋找PD的易感基因?qū)τ陉U明遺傳因素在散發(fā)性PD中的作用具有重要意義。一般認(rèn)為,在遺傳因素、環(huán)境因素和老齡化的共同作用下,神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙、溶酶體功能障礙、α-syn朊蛋白樣的傳播等多方面的機(jī)制參與了DA能神經(jīng)元的損傷與死亡,促進(jìn)了PD的發(fā)生發(fā)展。其中小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在導(dǎo)致DA能神經(jīng)元最終死亡的級聯(lián)反應(yīng)中起到了重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system, CNS)常駐巨噬細(xì)胞,它在神經(jīng)炎癥中具有雙面作用：一方面可監(jiān)控CNS內(nèi)環(huán)境,吞噬、清除變性死亡的神經(jīng)元,避免組織損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥,這是機(jī)體保護(hù)性機(jī)制之一；另一方面,它被過度活化后,則可持續(xù)分泌白介素-1β (Interleukin-1β, IL-1p)、白介素-6 (Interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)等炎癥因子,導(dǎo)致神經(jīng)炎癥持續(xù)存在。在PD患者及MPTP小鼠的病理研究中,均發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)出現(xiàn)大量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞,且小膠質(zhì)細(xì)胞的激活先于DA能神經(jīng)元的死亡,說明神經(jīng)炎癥并不只是神經(jīng)元變性死亡的伴隨結(jié)果,而是參與了促進(jìn)DA能神經(jīng)元死亡的過程。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可直接誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,或間接引起氧化應(yīng)激,共同促進(jìn)了DA能神經(jīng)元最終的死亡,加速了PD的進(jìn)展。因此,及時阻斷神經(jīng)炎癥,有望成為PD神經(jīng)保護(hù)治療的潛在靶點(diǎn)。髓樣細(xì)胞表達(dá)的觸發(fā)受體-2 (Triggering receptor expressed on myeloid cells-2, TREM2)是表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及破骨細(xì)胞等髓樣細(xì)胞膜表面的免疫受體。研究表明,刺激小膠質(zhì)細(xì)胞表面的TREM2受體一方面可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活動,另一方面可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子,如TNF-α、IL-1β及IL-6等。換言之,TREM2可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞清除CNS中受損或凋亡的細(xì)胞及細(xì)胞碎片,預(yù)防和緩解組織損傷所致的神經(jīng)炎癥,從而起到抗炎作用。最近,TREM2在阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)和PD等多種神經(jīng)退行性疾病中的作用頗受關(guān)注。2013年,兩項(xiàng)獨(dú)立的GWAS研究先后證實(shí)了位于TREM2基因外顯子2上的rs75932628 (p.R47H)位點(diǎn)的錯義突變C/T可使美國及歐洲人群患AD的風(fēng)險(xiǎn)增加近3倍。2013年,Rayaprolu等病例對照研究顯示,TREM2基因rs75932628位點(diǎn)C/T雜合突變是美國人群散發(fā)性PD的易感因素(OR值為2.67)。2014年,西班牙和美國人群中的研究亦驗(yàn)證了rs75932628位點(diǎn)C/T雜合突變與散發(fā)性PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。另外,多項(xiàng)研究顯示,rs75932628位點(diǎn)C/T雜合突變是額顳葉癡呆和肌萎縮側(cè)索硬化的遺傳易感因素,提示TREM2基因多態(tài)性與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān),可能在神經(jīng)退行性疾病病理生理過程中起到了重要作用。在正常人腦組織中,TREM2基因的mRNA表達(dá)水平在腦白質(zhì)、中腦黑質(zhì)、殼核的小膠質(zhì)細(xì)胞中較高,在小腦中表達(dá)相對較低。而病理研究發(fā)現(xiàn),在5例有TREM2突變的正常人腦組織中,其中有2例腦組織存在LB病理樣改變,提示TREM2突變可能與PD的病理改變存在關(guān)系。另外,盡管TREM2配體具體是何種物質(zhì)目前尚不清楚,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DA能神經(jīng)元可表達(dá)與TREM2結(jié)合的配體,使得死亡的DA能神經(jīng)元被小膠質(zhì)細(xì)胞識別并吞噬。綜合以上研究結(jié)果,我們有充分的理由推測TREM2可能在PD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。TREM2作為介導(dǎo)吞噬的免疫受體,可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞清除CNS中受損或凋亡的細(xì)胞及細(xì)胞碎片,抑制神經(jīng)炎癥；那么,在PD中,TREM2能否通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對變性死亡的DA能神經(jīng)元和胞外α-syn的吞噬,同時下調(diào)神經(jīng)炎癥,從而減少細(xì)胞外α-syn的堆積呢?目前未見相關(guān)研究報(bào)道。另外,基因多態(tài)性受地域差異和種族差異影響較大,但中國漢族人群中TREM2基因多態(tài)性與PD易感性的關(guān)聯(lián)研究尚未見報(bào)道。因此,本研究擬對TREM2基因第2外顯子進(jìn)行直接測序,并分析TREM2基因多態(tài)性與中國漢族人群PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性。并進(jìn)一步在MPTP慢性PD模型小鼠中研究TREM2、α-syn,及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)水平,以初步探討TREM2在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的PD神經(jīng)炎癥中的作用。本研究包括兩部分：1.TREM2基因多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)性研究；2.MPTP誘導(dǎo)的PD慢性模型小鼠中TREM2基因的表達(dá)水平研究。第一章TREM2基因多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)性研究目的：探討TREM2基因多態(tài)性與帕金森病患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是否相關(guān)。方法：以476例PD患者及432例正常對照者作為研究對象。(1)收集所有受試者的一般資料和血液標(biāo)本。(2)提取所有受試者血液標(biāo)本的DNA,對TREM2第2外顯子進(jìn)行直接測序。(3)比較PD患者及正常對照的TREM2第2外顯子中rs75932628、rs142232675、rs201258663、rs143332484、p.Y38C及rs104894002位點(diǎn)的等位基因和基因型總體分布差異。率的比較用χ2檢驗(yàn),P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：①PD組和正常對照組在年齡和性別分布上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。②在908例進(jìn)行測序的受試者中,僅在1例PD患者中檢測到rs75932628位點(diǎn)存在C/T雜合突變,其最小等位基因頻率(MAF)為0.06%。Rs142232675、 rs201258663、rs143332484、p.Y38C、rs104894002及其他位點(diǎn)未檢測到雜合突變或純合突變。③PD患者和正常對照的rs75932628、rs201258663、rs143332484、p.Y38C及rs104894002等其他位點(diǎn)的基因型及等位基因分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：(1)中國南方漢族人群TREM2基因外顯子2區(qū)域突變頻率低于起源于歐洲的人群。(2)Rs75932628位點(diǎn)等位基因“T”不是中國南方漢族人群PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的易感等位基因。第二章MPTP誘導(dǎo)的PD慢性模型小鼠中TREM2基因的表達(dá)水平研究目的：比較MPTP腹腔注射誘導(dǎo)的PD模型小鼠與對照小鼠中TREM2及其下游炎癥因子的表達(dá)水平是否存在差異,以初步探討TREM2在PD神經(jīng)炎癥中的作用。方法：以C57BL/6J小鼠為研究對象,分為MPTP+丙磺舒模型組,丙磺舒對照組和生理鹽水對照組三組。通過小劑量MPTP長期腹腔注射誘導(dǎo)PD慢性模型。取腦組織后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：(1)進(jìn)行石蠟切片,用免疫組織化學(xué)染色方法檢測小鼠中腦黑質(zhì)TH染色陽性細(xì)胞。(2)提取腦組織總RNA,用熒光定量PCR方法檢測TREM2、α-syn、IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS基因的mRNA表達(dá)水平。采用單因素方差分析比較三組間多巴胺能神經(jīng)元死亡情況、TREM2基因、α-syn基因及炎癥因子的mRNA表達(dá)水平,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：①M(fèi)PTP模型組中TH染色陽性細(xì)胞數(shù)低于丙磺舒對照組及生理鹽水對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),MPTP模型組中TH染色陽性細(xì)胞數(shù)目較生理鹽水對照組減少了42.8%。②MPTP模型組、生理鹽水對照組及丙磺舒對照組三組間TREM2.IL-1β、 IL-6、TNF-α及iNOS基因mRNA相對表達(dá)水平有顯著性差異(P0.05),MPTP組顯著高于生理鹽水組及丙磺舒組(P0.05)。MPTP組SNCA基因mRNA相對表達(dá)水平高于生理鹽水組及丙磺舒組,但三組間比較未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：(1) MPTP聯(lián)合丙磺舒腹腔注射建立的PD慢性小鼠模型中,中腦黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元顯著減少,PD模型中存在明顯的神經(jīng)炎癥。(2) MPTP小鼠PD慢性模型中腦TREM2基因mRNA表達(dá)增高,提示TREM2在PD發(fā)病過程中起到一定作用,TREM2對PD發(fā)病是否具有保護(hù)保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
【關(guān)鍵詞】：帕金森病 TREM2 基因多態(tài)性 神經(jīng)炎癥 神經(jīng)退行性變 帕金森病 神經(jīng)炎癥 TREM2 α-突觸核蛋白 小膠質(zhì)細(xì)胞 多巴胺能神經(jīng)元
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-22
• 第一章 TREM2基因多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)性研究22-37
• 1 研究對象和方法25-31
• 2 結(jié)果31-33
• 3 討論33-36
• 4 結(jié)論36-37
• 第二章 MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型中的TREM2表達(dá)水平研究37-54
• 1 實(shí)驗(yàn)動物和方法40-48
• 2 結(jié)果48-51
• 3 討論51-53
• 4 結(jié)論53-54
• 全文總結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-65
• 英文縮略詞65-67
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文67-69
• 致謝69-70

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李芳菲;馮濤;;2013年歐洲神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟帕金森病診斷指南解讀[J];中國實(shí)用內(nèi)科雜志;2013年11期

2 李健;謝南姿;王娟;王海峰;;神經(jīng)節(jié)苷脂治療老年帕金森病療效觀察[J];同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2015年02期

3 譚瑞s，

本文編號：982382