本文關(guān)鍵詞：構(gòu)建大鼠白細(xì)胞介素1β基因shRNA及過(guò)表達(dá)腺病毒載體

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【摘要】：目的:神經(jīng)病理性疼痛是目前麻醉工作中常見(jiàn)的一種難治性的慢性疼痛,其具體的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜,有眾多的細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)參與其中。研究表明,白細(xì)胞介素1β(IL-1β)是其中一種起主要作用的細(xì)胞因子,其在體內(nèi)表達(dá)水平的上升是誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛的重要因素。特異性下調(diào)體內(nèi)IL-1β蛋白的表達(dá)水平能夠有效緩解由軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后直接導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛。采用基因治療領(lǐng)域的RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)可以在基因水平下調(diào)IL-1β在體內(nèi)的表達(dá)。其具體原理是通過(guò)設(shè)計(jì)并合成IL-1β特異性的小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA),在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制目的蛋白的表達(dá)。與si RNA相比,短發(fā)卡狀RNA(short hairpin RNA,sh RNA)可以更加穩(wěn)定、高效地抑制目的蛋白的表達(dá),但是單純的sh RNA并無(wú)法高效地進(jìn)入靶細(xì)胞中發(fā)揮對(duì)目的蛋白的下調(diào)作用,因此必須借助一定的載體。而腺病毒載體的特點(diǎn)是可以感染大多數(shù)的細(xì)胞,并且其感染效率較高以及能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)等特點(diǎn)。因此,本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)構(gòu)建IL-1β的sh RNA腺病毒載體以及過(guò)表達(dá)腺病毒載體來(lái)觀察其對(duì)目的蛋白表達(dá)水平的影響,從而進(jìn)一步為麻醉工作中神經(jīng)病理性疼痛的診治提供一種有效措施。具體目的是構(gòu)建大鼠IL-1β基因的sh RNA腺病毒載體以及過(guò)表達(dá)腺病毒載體并檢測(cè)其對(duì)目的蛋白表達(dá)水平的影響。方法:構(gòu)建IL-1β的sh RNA腺病毒載體:根據(jù)NCBI中查詢獲得的大鼠IL-1β基因序列設(shè)計(jì)3條si RNA并合成相應(yīng)的sh RNA,分別為sh RNA1、sh RNA2、sh RNA3。將采用3’和5’單鏈退火得到的sh RNA基因產(chǎn)物和經(jīng)過(guò)Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切的p HBAd/U6/GFP載體連接,構(gòu)建IL-1βsh RNA腺病毒載體穿梭質(zhì)粒。之后將得到的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大鼠感受態(tài)細(xì)胞DH5α,在培養(yǎng)皿中挑菌后將菌液交與上海尼桑生物技術(shù)有限公司對(duì)其中的基因序列進(jìn)行測(cè)定。測(cè)序完成后將穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒(p HBAd/BHG)共轉(zhuǎn)染HEK(人胚腎)293細(xì)胞,進(jìn)行IL-1β基因的sh RNA腺病毒載體(r Ad/sh RNAs)的包裝與擴(kuò)增,所得產(chǎn)物分別為r Ad/sh RNA1、r Ad/sh RNA2、r Ad/sh RNA3。將r Ad/sh RNAs感染培養(yǎng)好的大鼠H9C2細(xì)胞,使用熒光顯微鏡觀察其對(duì)細(xì)胞的感染效率,然后采用Western Blot測(cè)定r Ad/sh RNAs對(duì)目的蛋白表達(dá)水平的影響。構(gòu)建IL-1β的過(guò)表達(dá)腺病毒載體:通過(guò)NCBI查詢得到大鼠IL-1β的基因序列,設(shè)計(jì)引物并使用PCR技術(shù)擴(kuò)增其CDS(Coding sequence)區(qū)。取p HBAd/MCMV/RFP干擾載體,與得到的基因片段均采用Eco RI和Not I雙酶切處理。酶切之后,將擴(kuò)增的基因片段與干擾載體相連接,構(gòu)建大鼠IL-1β的過(guò)表達(dá)腺病毒載體穿梭質(zhì)粒。之后將構(gòu)建完成的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,在培養(yǎng)皿中挑菌后將產(chǎn)物交與上海尼桑生物技術(shù)有限公司對(duì)其中的基因序列進(jìn)行測(cè)定。序列測(cè)定完成后將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒(p HBAd/BHG)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,進(jìn)行IL-1β過(guò)表達(dá)腺病毒載體(r Ad/IL-1β)的包裝與擴(kuò)增。最后將構(gòu)建完成的r Ad/IL-1β感染培養(yǎng)好的大鼠H9C2細(xì)胞,使用熒光顯微鏡觀察其對(duì)宿主細(xì)胞的感染效率,采用Western Blot驗(yàn)證IL-1β的過(guò)表達(dá)。結(jié)果:測(cè)序結(jié)果顯示IL-1β基因的3條sh RNA腺病毒載體穿梭質(zhì)粒中的序列分別與所設(shè)計(jì)的3條sh RNA序列相同;過(guò)表達(dá)腺病毒載體穿梭質(zhì)粒中的序列與NCBI中查詢獲得的大鼠IL-1β的基因序列相同。成功構(gòu)建了大鼠IL-1β基因的sh RNA腺病毒載體(r Ad/sh RNA1、r Ad/sh RNA2、r Ad/sh RNA3)和過(guò)表達(dá)腺病毒載體(r Ad/IL-1β)。r Ad/sh RNA1、r Ad/sh RNA2、r Ad/sh RNA3均可以下調(diào)IL-1β蛋白的表達(dá),其中r Ad/sh RNA2的下調(diào)效果最明顯,而r Ad/IL-1β則可以明顯上調(diào)IL-1β蛋白的表達(dá)。結(jié)論:大鼠白細(xì)胞介素1β基因的sh RNA腺病毒載體的應(yīng)用為臨床麻醉工作中對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛的治療提供了一種新的思路,表明了基因治療技術(shù)在疼痛治療領(lǐng)域中也具有廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)病理性疼痛 白細(xì)胞介素1β RNA干擾 短發(fā)卡RNA 腺病毒載體
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R741
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 常用縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照表11-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-25
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料14-17
• 1.2 常用緩沖液的配制方法17-18
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法18-23
• 1.4 主要觀察指標(biāo)23-24
• 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24-25
• 2 結(jié)果25-30
• 2.1 IL-1β 的shRNA及過(guò)表達(dá)腺病毒載體穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建25
• 2.2 腺病毒載體感染效率的鑒定25-27
• 2.3 Western Blot檢測(cè)rAd/shRNAs對(duì)IL-1β 表達(dá)水平的影響27-29
• 2.4 Western Blot檢測(cè)r Ad/IL-1β 對(duì)目的蛋白表達(dá)水平的影響29-30
• 3 討論30-33
• 4 結(jié)論33-34
• 參考文獻(xiàn)34-38
• 綜述38-49
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 致謝49-50
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果50-51
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷51

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳杰;;外周血IL-1β和IL-6水平與腰椎間盤(pán)突出癥腰腿痛疼痛程度的臨床研究[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2012年12期

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本文編號(hào)：975815