本文關(guān)鍵詞：鐵在α-突觸核蛋白磷酸化中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 鐵 PLK2 CK2 α-突觸核蛋白 帕金森病

【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的多發(fā)于中老年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。主要臨床表現(xiàn)包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌僵直和姿勢步態(tài)障礙等。其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的變性死亡以及路易小體形成。目前,PD的確切病因仍未完全明了,包括遺傳因素、環(huán)境因素和老化因素。氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、凋亡、蛋白異常聚集、鐵的過度沉積等均可能參與了PD的發(fā)病過程。α-突觸核蛋白是PD特征性病理標(biāo)志路易小體的主要成分,與家族性及散發(fā)性的PD有密切聯(lián)系,其異常聚集被認(rèn)為是PD發(fā)病的核心機(jī)制。α-突觸核蛋白的翻譯后修飾有多種形式,如磷酸化、泛素化、糖基化、硝基化等,其中蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能最常見的,也是最重要的翻譯后修飾方式。在生理?xiàng)l件下,大鼠體內(nèi)約有4%的α-突觸核蛋白處于第129位絲氨酸位點(diǎn)(Sl29)磷酸化狀態(tài),但在路易小體中有90%的α-突觸核蛋白Sl29被磷酸化。α-突觸核蛋白的磷酸化狀態(tài)很明顯可以影響其表達(dá)和聚集,磷酸化與α-突觸核蛋白的清除機(jī)制相關(guān)。一些研究顯示α-突觸核蛋白Sl29磷酸化(p S129)促進(jìn)包涵體形成,而另一些研究顯示磷酸化作為代償反應(yīng)抑制包涵體形成或根本不起作用。因此,α-突觸核蛋白的磷酸化對于其表達(dá)和聚集起到促進(jìn)還是抑制作用,尚未明確。尸檢表明,PD病人的黑質(zhì)區(qū)鐵含量明顯上升,且黑質(zhì)鐵的水平與PD的進(jìn)程相關(guān),鐵的過度沉積可能是PD發(fā)病中的關(guān)鍵因素。異常增加的鐵水平促進(jìn)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生從而對DA能神經(jīng)元造成損傷。前期研究證實(shí)鐵可誘導(dǎo)α-突觸核蛋白的表達(dá)及聚集,但該過程是否與α-突觸核蛋白的磷酸化有關(guān)尚不明確。Polo樣激酶2(polo-like kinase 2,PLK2)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,能特異性地磷酸化α-突觸核蛋白S129。酪蛋白激酶2(casein kinase 2,CK2)是一種常見的含兩個(gè)α或α’催化亞基與兩個(gè)β調(diào)節(jié)亞基的絲氨酸/蘇氨酸激酶。鐵作用于α-突觸核蛋白的磷酸化過程中是否有這兩種激酶的參與也尚不明確。本研究在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞上,應(yīng)用免疫印跡方法檢測了枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate,FAC)處理后,α-突觸核蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平,PLK2和CK2表達(dá)水平,以及自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)變化。用蛋白酶體活性檢測試劑盒檢測FAC對細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性的影響。用PLK2的抑制劑BI2536、CK2的抑制劑TBCA以及抗氧化劑N-乙�；�-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)預(yù)處理后,檢測鐵對上述指標(biāo)影響的變化,以闡明鐵在α-突觸核蛋白磷酸化中的作用及機(jī)制。研究結(jié)果如下:1.1 mmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h,α-突觸核蛋白表達(dá)水平于12 h開始增加,1 mmol/L FAC處理12 h~48 h后α-突觸核蛋白表達(dá)水平分別增加81%、90%、93%、66%、51%,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果提示,鐵能夠誘導(dǎo)α-突觸核蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化逐漸上調(diào),隨后表達(dá)上調(diào)的程度有所減弱。2.1 mmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h,p S129表達(dá)水平于12 h開始增加,1 mmol/L FAC處理12 h~48 h后p S129表達(dá)水平分別增加115%、127%、152%、106%、68%,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。α-突觸核蛋白的磷酸化水平于16 h開始增加,1 mmol/L FAC處理16 h~48 h后p S129與α-突觸核蛋白的比值分別增加42%、42%、47%、51%,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果提示,鐵能夠誘導(dǎo)α-突觸核蛋白的磷酸化水平隨時(shí)間變化逐漸上調(diào)。3.1 mmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h,PLK2表達(dá)于12 h開始增加,1 mmol/L FAC處理12 h~48 h后PLK2表達(dá)水平分別增加33%、30%、53%、44%、35%,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);CK2表達(dá)于24 h開始增加,1 mmol/L FAC處理24 h與48 h后CK2表達(dá)水平分別增加46%與48%,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果提示,鐵能夠誘導(dǎo)PLK2和CK2表達(dá)隨時(shí)間變化逐漸上調(diào),PLK2表達(dá)上調(diào)的程度隨后有所減弱,CK2的上調(diào)明顯晚于PLK2。4.20μmol/L TBCA、1μmol/L BI2536、20μmol/L TBCA與1μmol/L BI2536分別預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞30min后與1 mmol/L FAC共孵育24 h,α-突觸核蛋白表達(dá)水平分別降低43%、44%、41%,與FAC組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);α-突觸核蛋白的磷酸化水平分別降低27%、31%、32%,與FAC組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)果提示,CK2和PLK2的抑制劑可阻斷高鐵誘導(dǎo)的α-突觸核蛋白的磷酸化水平及表達(dá)水平增加。5.20μmol/L TBCA處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,PLK2表達(dá)水平增加41%,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1μmol/L BI2536處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,與對照組相比,CK2表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。結(jié)果提示,細(xì)胞內(nèi)CK2的活性變化會(huì)影響PLK2的表達(dá),作用于同一靶點(diǎn)的不同激酶之間存在相互影響。6.0.5 mmol/L NAC預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞30 min后與1 mmol/L FAC共孵育24 h,PLK2與CK2的蛋白表達(dá)水平以及α-突觸核蛋白的磷酸化水平回到正常,與FAC組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。然而NAC和FAC共孵育24 h后α-突觸核蛋白表達(dá)水平仍比對照組高出32%,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果提示,抗氧化劑NAC能夠完全阻斷高鐵誘導(dǎo)的PLK2和CK2表達(dá)水平以及α-突觸核蛋白磷酸化水平上調(diào),僅部分阻斷高鐵誘導(dǎo)的α-突觸核蛋白表達(dá)上調(diào)。7.1 mmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和蛋白酶體活性分別增加147%和12%,與對照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。0.5 mmol/L NAC預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞30 min后與1 mmol/L FAC共孵育24 h,LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值下調(diào)22%,與FAC組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);蛋白酶體活性與FAC組相比下調(diào)5%。結(jié)果提示,鐵能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬水平和蛋白酶體活性增加,抗氧化劑NAC能夠部分阻斷鐵誘導(dǎo)的該上調(diào)作用,與α-突觸核蛋白的表達(dá)變化相一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鐵負(fù)載可上調(diào)α-突觸核蛋白的表達(dá),抗氧化劑NAC處理可部分阻斷該上調(diào)作用,提示氧化應(yīng)激參與了鐵誘導(dǎo)的α-突觸核蛋白表達(dá)上調(diào)。高鐵可上調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶PLK2和CK2的蛋白表達(dá)水平,從而上調(diào)α-突觸核蛋白的磷酸化水平。CK2和PLK2的抑制劑可阻斷高鐵誘導(dǎo)的α-突觸核蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平增加。其中PLK2在鐵誘導(dǎo)磷酸化過程中的作用更明顯。高鐵誘導(dǎo)的PLK2和CK2表達(dá)水平和α-突觸核蛋白磷酸化水平上調(diào)可被NAC阻斷,說明氧化應(yīng)激在鐵對α-突觸核蛋白磷酸化的影響過程中起到關(guān)鍵作用。高鐵處理后細(xì)胞內(nèi)自噬水平和泛素蛋白酶體活性增加,NAC預(yù)處理可部分阻斷該上調(diào)作用,與α-突觸核蛋白的表達(dá)變化相一致,表明這兩個(gè)系統(tǒng)的激活可能是作為細(xì)胞增強(qiáng)對α-突觸核蛋白的清除而發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)所研究的鐵對α-突觸核蛋白磷酸化的作用影響以及對其可能機(jī)制的初步探討,為進(jìn)一步深入探討PD發(fā)病過程中鐵與α-突觸核蛋白相互作用的機(jī)制及干預(yù)措施,提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：鐵 PLK2 CK2 α-突觸核蛋白 帕金森病
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 摘要2-5
• Abstract5-10
• 引言10-12
• 材料和方法12-20
• 1. 神經(jīng)母細(xì)胞瘤系SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)12-13
• 2. α-synuclein，pS129，PLK2，CK2，，LC3蛋白表達(dá)的檢測13-18
• 3. 泛素蛋白酶體活性的檢測18-19
• 4. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理19-20
• 結(jié)果20-28
• 1. 鐵誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中 α-突觸核蛋白表達(dá)上調(diào)20
• 2. 鐵促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞中 α-突觸核蛋白的磷酸化20-21
• 3. 磷酸激酶PLK2和CK2介導(dǎo)了鐵誘導(dǎo)的 α-突觸核蛋白的磷酸化水平上調(diào)21-24
• 4. 氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了鐵誘導(dǎo)的PLK2、CK2、α-突觸核蛋白的表達(dá)和磷酸化水平上調(diào)24-25
• 5. 鐵誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中蛋白清除系統(tǒng)的功能增強(qiáng)25-28
• 討論28-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-38
• 綜述38-56
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果56-57
• 縮略詞表57-58
• 致謝58-59

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉翠中;鄒燕;王翔;;熱休克蛋白70減輕帕金森病細(xì)胞模型中α-突觸核蛋白毒性的作用[J];中國老年學(xué)雜志;2010年22期

2 沈原;趙永波;劉功祿;趙圣杰;;α-突觸核蛋白的表達(dá)與氧化應(yīng)激水平的相互影響[J];中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2011年03期

3 夏娟;高靜;熊御云;邱晶;馬瑞;錢進(jìn)軍;;胞質(zhì)和核定位α-突觸核蛋白過表達(dá)對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的影響[J];南京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年01期

4 梁源,楊慧;線粒體、α-突觸核蛋白在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用[J];中國臨床康復(fù);2005年09期

5 劉延英;楊慧;;神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展:α-突觸核蛋白與線粒體[J];中國臨床康復(fù);2006年18期

6 陳濤;唐北沙;廖小平;;α-突觸核蛋白在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用[J];中華神經(jīng)科雜志;2006年06期

7 劉光偉;殷娟娟;張春巖;李昕;劉耀波;李堯華;楊慧;陳彪;于順;;α-突觸核蛋白存在于大鼠腦線粒體中[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年03期

8 牛丕業(yè);李慧;張意;張漫;肖揚(yáng);李變蘭;肖忠新;高艾;田琳;;錳對大鼠大腦α-突觸核蛋白表達(dá)的影響[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2009年20期

9 李文靜;姜宏;宋寧;謝俊霞;;鐵離子對α-突觸核蛋白聚集的誘發(fā)作用具有劑量和時(shí)間依賴性(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2010年03期

10 楊智源;呂春香;王鵬;;重組人α-突觸核蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)的建立及純化方法[J];中國老年學(xué)雜志;2011年09期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 杜蕓蘭;劉振國;陳生弟;李彪;陸國強(qiáng);;帕金森病小鼠模型α-突觸核蛋白表達(dá)升高并集聚[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

2 牛丕業(yè);李慧;張意;張漫;肖揚(yáng);李變蘭;肖忠新;高艾;田琳;;錳致大鼠大腦α-突觸核蛋白表達(dá)的影響[A];中國毒理學(xué)會(huì)第五次全國學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2009年

3 杜蕓蘭;劉振國;陳生弟;陸國強(qiáng);;百草枯誘導(dǎo)α-突觸核蛋白聚集的在體實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

4 杜蕓蘭;劉振國;陳生弟;陸國強(qiáng);;百草枯誘導(dǎo)α-突觸核蛋白聚集的在體實(shí)驗(yàn)研究[A];第七屆全國老年醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨海內(nèi)外華人老年醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

5 于順;張晨;韓俊燕;溫玫;李昕;李堯華;蔡燕寧;陳彪;;α-突觸核蛋白對多巴胺神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制[A];中國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)會(huì)成立十周年慶祝大會(huì)論文摘要匯編[C];2005年

6 于順;劉光偉;殷娟娟;李昕;謝勝男;李堯華;楊慧;陳彪;;α-突觸核蛋白在腦神經(jīng)元線粒體中的定位及其對線粒體復(fù)合體Ⅰ活性的調(diào)控作用[A];第十一屆全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

7 李昕;程芙蓉;李堯華;于順;;α-突觸核蛋白對N-甲基-D-天門冬氨酸所致細(xì)胞毒性作用的影響[A];2011全國老年癡呆與衰老相關(guān)疾病學(xué)術(shù)會(huì)議第三屆山東省神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師（學(xué)術(shù)）論壇論文匯編[C];2011年

8 韓俊燕;張晨;李昕;李堯華;陳彪;于順;;α-突觸核蛋白寡聚中間體的制備以及分離與純化[A];中國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)會(huì)成立十周年慶祝大會(huì)論文摘要匯編[C];2005年

9 李昕;王鵬;李堯華;何欣;于順;;α-突觸核蛋白對大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元突起的促生長作用[A];第十一屆全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

10 王嵐;孫圣剛;曹學(xué)兵;張振濤;喬嫻;劉紅進(jìn);;格爾德霉素誘發(fā)熱休克蛋白反應(yīng)抑制α-突觸核蛋白異常聚集和細(xì)胞毒性作用[A];第九次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2006年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 本報(bào)記者 楊雪;探尋治愈頑疾之路[N];科技日報(bào);2013年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 郜麗妍;H-Y1-2期帕金森病唇腺α-突觸核蛋白病變與腦多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體代謝對照的生物學(xué)標(biāo)記物研究[D];首都醫(yī)科大學(xué);2016年

2 胡丹;魚藤酮誘導(dǎo)α-突觸核蛋白聚集及其機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2008年

3 李文偉;α-突觸核蛋白參與MPTP誘導(dǎo)帕金森病模型的關(guān)鍵機(jī)制及蓯蓉總苷干預(yù)作用的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

4 孔濱;RNA干擾GCase對α-突觸核蛋白的影響及其機(jī)制的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

5 吳鳳霞;RNA干擾α-突觸核蛋白對多巴胺能神經(jīng)元的影響及其機(jī)制[D];山東大學(xué);2009年

6 李海濤;脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)12亞型的基因特點(diǎn)、腦白質(zhì)微細(xì)結(jié)構(gòu)損害影像學(xué)特點(diǎn)、血漿α-突觸核膜蛋白表達(dá)水平的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2014年

7 陳蕾;α-突觸核蛋白病SNCA基因A30P和A53T的突變篩查[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

8 陳玲;RNA干擾α-突觸核蛋白基因表達(dá)對甲基苯丙胺神經(jīng)毒性的影響及其機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張瑞鋒;多系統(tǒng)萎縮患者皮膚組織中泛素和α-突觸核蛋白的表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2015年

2 白小燕;α-突觸核蛋白基因多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)研究[D];內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院;2014年

3 周麗敏;人工合成多肽降解α-突觸核蛋白對帕金森病的治療作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

4 張琳;α-突觸核蛋白與帕金森病的相關(guān)性[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2016年

5 王冉冉;鐵在α-突觸核蛋白磷酸化中的作用及機(jī)制研究[D];青島大學(xué);2016年

6 劉志國;α-突觸核蛋白對多巴胺能細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響及其可能機(jī)制研究[D];青島大學(xué);2016年

7 元紅花;不同機(jī)制細(xì)胞毒性藥物對人少突膠質(zhì)細(xì)胞系α-突觸核蛋白表達(dá)的影響[D];吉林大學(xué);2015年

8 楊斌;α-突觸核蛋白和硝基化α-突觸核蛋白在食蟹猴結(jié)腸組織中的表達(dá)[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2014年

9 于曉俊;帕金森病鐵代謝異常的腦區(qū)差異和細(xì)胞易感性差異研究[D];青島大學(xué);2013年

10 喻哲明;β-淀粉樣蛋白_(1-42)促進(jìn)α-突觸核蛋白聚集的機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

本文編號：960714