本文關(guān)鍵詞：肝豆湯對Wilson病脾臟免疫功能的影響及調(diào)節(jié)作用機制的相關(guān)研究

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【摘要】：研究背景Wilson病是一種常染色體隱性遺傳銅代謝障礙性疾病。目前WD合并脾功能亢進(jìn)的患者不在少數(shù),這類患者體內(nèi)存在著免疫功能的紊亂,且推測可能與脾臟免疫功能狀態(tài)的改變有著密切的聯(lián)系。但其內(nèi)在機制尚不清楚,目前鮮有相關(guān)的文獻(xiàn)報道。作為少數(shù)可治的神經(jīng)遺傳病之一,Wilson病目前以運用銅離子螯合劑行驅(qū)銅治療為主,但缺點是不良反應(yīng)多。肝豆湯作為一種中藥配方治療Wilson病在臨床上被證明是有效的,具有不良反應(yīng)少,作用持久、和緩的特點。楊任民等Wilson病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究團(tuán)隊根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論和多年的臨床經(jīng)驗總結(jié),將肝豆湯原方制成肝豆片應(yīng)用于Wilson病的臨床治療,在驅(qū)銅效果和臨床癥狀的改善方面均取得了較為滿意的療效。目前針對肝豆湯藥理機制尚處于研究階段,有必要對其是否能夠通過調(diào)節(jié)Wilson病脾臟免疫功能產(chǎn)生治療作用開展相關(guān)研究。TX小鼠的遺傳背景、銅生化特征以及病理特點與Wilson病類似,因此可作為Wilson病研究較理想的動物模型。研究表明,Wilson病的免疫功能紊亂與多種因素有關(guān),如肝臟損害處理抗原能力的減弱、腸源性內(nèi)毒素血癥、細(xì)胞因子的紊亂、門靜脈高壓合并脾功能亢進(jìn)、微量元素代謝及生物轉(zhuǎn)化障礙等;脾臟是人類和其它哺乳動物(如小鼠)的細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。它參與T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)外周血T細(xì)胞的數(shù)量與分布;參與介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞抗原提呈反應(yīng);參與制造免疫球蛋白、補體等免疫物質(zhì),促進(jìn)吞噬作用,清除體內(nèi)外抗原;同時脾血竇還具有貯存血液、必要時補充血容量,以及吞噬衰老的紅細(xì)胞、病原體和異物的功能。脾臟免疫功能的紊亂是多種疾病發(fā)生及進(jìn)展的主要原因,它是否也與Wilson病免疫功能異常有重要的關(guān)聯(lián),目前未見相關(guān)報道。第一部分:楊任民等Wilson病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究團(tuán)隊?wèi)?yīng)用肝豆湯(片)治療Wilson病的理論依據(jù)及臨床經(jīng)驗總結(jié)1.總結(jié)楊任民等Wilson病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究團(tuán)隊對于Wilson病中醫(yī)辨證論治的基本觀點和方法;2.對于楊任民等Wilson病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究團(tuán)隊?wèi)?yīng)用肝豆湯(片)治療Wilson病的臨床經(jīng)驗和相關(guān)研究成果進(jìn)行總結(jié);3.肝豆湯對于Wilson病患者免疫相關(guān)指標(biāo)的改善及治療方面研究總結(jié)第二部分:肝豆湯對Wilson病脾臟細(xì)胞免疫功能影響的實驗研究目的:了解Wilson病模型TX小鼠脾臟病理、細(xì)胞免疫指標(biāo)的表達(dá)、微量元素代謝狀況,以及肝豆湯對TX小鼠脾臟的細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)影響與改善,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對TX小鼠脾臟細(xì)胞免疫狀態(tài)及肝豆湯治療作用的相關(guān)機制進(jìn)行探討。方法:1.肝豆湯治療組:隨機選取2月齡TX小鼠40只歸為肝豆湯治療組,該組每日分兩次予中藥0.2ml/10g/次灌胃給藥,連續(xù)30天;模型組:隨機選取2月齡TX小鼠40只歸為TX模型組,每日分兩次予生理鹽水各0.2ml/10g/次灌胃,連續(xù)30天。正常對照組:隨機選取正常2月齡DL小鼠40只,進(jìn)行正常飼養(yǎng),連續(xù)30天。三組在30天后每組隨機選取20只小鼠行頸椎脫臼法處死,留取脾臟標(biāo)本。2.通過對脾組織冰凍切片行HE染色,觀察Wilson病模型TX小鼠脾組織病理形態(tài)的改變。3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾組織T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+,Western-Blot檢測白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白細(xì)胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的表達(dá),了解肝豆湯對于Wilson病模型TX小鼠脾臟細(xì)胞免疫狀態(tài)的影響與改善。4.通過等離子體原子發(fā)射光譜法檢測各組Wilson病模型TX小鼠脾組織中銅、鋅、鐵微量元素的含量,了解肝豆湯對于Wilson病模型TX小鼠脾臟微量元素代謝的影響。結(jié)果:1.TX小鼠脾組織病理形態(tài)特點及變化肝豆湯組TX小鼠脾臟HE染色切片可見白髓與紅髓分界較為清晰,白髓數(shù)量較正常對照組無明顯增加或減少,白髓中大量淋巴細(xì)胞聚集;紅髓區(qū)域脾索較對照組細(xì),數(shù)量減少,脾血竇與切片裂隙無法區(qū)分;脾小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)欠完整。400倍視野可見白髓邊緣有核深染細(xì)胞,巨噬細(xì)胞數(shù)量似有增多,個別形態(tài)異常的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)。模型組TX小鼠脾臟HE染色切片可見白髓與紅髓分界尚清晰,個別白髓形態(tài)被裂紋破壞,白髓中有大量淋巴細(xì)胞聚集;紅髓區(qū)域脾索數(shù)量較前兩組少、形態(tài)偏細(xì),脾血竇數(shù)量增多、明顯擴大;未發(fā)現(xiàn)完整脾小梁結(jié)構(gòu)。鏡下400倍視野可見白髓周圍核深染細(xì)胞,巨噬細(xì)胞數(shù)量似有增多。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)肝豆湯治療TX小鼠脾組織內(nèi)CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的表達(dá)三組小鼠表達(dá)于脾組織內(nèi)的T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+及CD4+/CD8+均存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p值分別為0、0、0.016,p0.01)。脾組織內(nèi)CD4+、CD8+的表達(dá)均是模型組TX小鼠最高,正常對照組DL小鼠最低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;而肝豆湯組及模型組TX小鼠脾臟CD4+/CD8+明顯低于正常對照組DL小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;肝豆湯組CD4+/CD8+與模型組相比稍高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3.Western-Blot法檢測經(jīng)肝豆湯治療TX小鼠脾組織內(nèi)IL-8、IL-18的蛋白定量表達(dá)三組間IL-18在脾組織內(nèi)的相對表達(dá)量有差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p值為0.045,p0.05);其中模型組脾組織IL-18相對表達(dá)量高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;而模型組與肝豆湯組、肝豆湯組與正常對照脾組織IL-18相對表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。三組間IL-8在脾組織內(nèi)的相對表達(dá)量有顯著差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p值為0,p0.01);其中模型組TX小鼠脾組織IL-8的相對表達(dá)量明顯高于其他兩組(p值分別為0、0,p0.01),具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義,;肝豆湯組TX小鼠脾組織IL-8的相對表達(dá)量高于正常對照組DL小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p值為0.04,p0.05)。4.經(jīng)肝豆湯治療TX小鼠脾臟微量元素的變化三組脾Zn含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F值為0.24,p值為0.787,p0.05)。三組脾Cu含量比較有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(H值為15.53,p值為0,p0.01);其中模型組TX小鼠脾Cu含量明顯高于其他兩組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p值分別為0.02、0,p0.05);肝豆湯組TX小鼠脾Cu含量略高于正常對照組DL小鼠,但無統(tǒng)計學(xué)意義(p值為0.6,p0.05)。三組脾Fe含量比較有差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義(H值為7.088,p值為0.029,p0.05);模型組TX小鼠脾Fe高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p值為0.04,p0.05);肝豆湯組TX小鼠脾Fe與其他兩組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(p值分別為0.89、0.13,p0.05)。結(jié)論:1.WD模型TX小鼠脾臟存在紅髓結(jié)構(gòu)的異常,包括脾索變細(xì)、數(shù)量減少,脾血竇擴張;巨噬細(xì)胞數(shù)量增多、個別形態(tài)異常;個別的細(xì)胞胞核深染等病理改變。肝豆湯中短期治療對TX小鼠脾臟形態(tài)改變不明顯。2.TX小鼠脾臟內(nèi)T淋巴細(xì)胞功能活躍,存在細(xì)胞免疫功能的亢進(jìn),但仍以負(fù)向免疫調(diào)節(jié)為主。肝豆湯對TX小鼠細(xì)胞免疫亢進(jìn)狀態(tài)具有改善調(diào)節(jié)作用,但僅依靠肝豆湯難以扭轉(zhuǎn)TX小鼠機體負(fù)向免疫調(diào)控的狀態(tài)。3.TX小鼠脾臟細(xì)胞因子IL-8、IL-18的高表達(dá)進(jìn)一步證明其存在細(xì)胞免疫亢進(jìn)的免疫紊亂狀態(tài),可能與TX小鼠因銅沉積引起的組織損傷、肝纖維化的免疫相關(guān)損傷機制有關(guān)聯(lián)。同時,其IL-18的高表達(dá)也可能是TX小鼠機體免疫紊亂的一種代償機制或負(fù)反饋機制,須進(jìn)一步研究加以證實。肝豆湯具有調(diào)節(jié)TX小鼠細(xì)胞因子相關(guān)免疫紊亂的作用,但在中短期療程對TX小鼠IL-8、IL-18調(diào)節(jié)能力有限。4.TX小鼠脾臟也是銅代謝異常所致銅沉積的靶器官之一;TX小鼠存在脾組織微量元素Cu、Zn的代謝異常,但是否存在脾Fe的代謝異常尚缺乏實驗證據(jù)。試驗證明肝豆湯對TX小鼠確有較為明顯的驅(qū)銅治療作用;而肝豆湯在排銅的同時也可能存在排鋅的作用;肝豆湯對TX小鼠脾Zn及脾Fe的代謝影響不顯著。
【關(guān)鍵詞】：肝豆湯 TX小鼠 脾臟 細(xì)胞免疫功能
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-17
• 英文縮略詞表17-18
• 前言18-20
• 第一部分：楊任民等Wilson病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究團(tuán)隊?wèi)?yīng)用肝豆湯（片）治療Wilson病的理論依據(jù)及臨床經(jīng)驗總結(jié)20-31
• 1 楊任民等Wilson病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究團(tuán)隊對Wilson病的中醫(yī)辨證論治20-21
• 2 楊任民等Wilson病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究團(tuán)隊臨床應(yīng)用肝豆湯治療WD的療效經(jīng)驗總結(jié)21-26
• 2.1 肝豆湯在中西醫(yī)結(jié)合治療方案中的應(yīng)用和臨床療效研究21-22
• 2.2 楊任民等Wilson病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究團(tuán)隊臨床應(yīng)用肝豆湯的經(jīng)驗匯總及分析22-26
• 3 肝豆湯改善Wilson病患者免疫相關(guān)指標(biāo)的研究總結(jié)26-31
• 3.1 Wilson病免疫功能紊亂相關(guān)機制的研究26-28
• 3.2 肝豆湯臨床應(yīng)用改善WD患者免疫指標(biāo)的研究經(jīng)驗1128-31
• 第二部分：肝豆湯對Wilson病脾臟免疫功能影響的實驗研究.1431-57
• 1 資料與方法31-42
• 1.1 實驗材料31-36
• 1.2 實驗技術(shù)路線與方法36-42
• 1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理42
• 2 實驗結(jié)果42-48
• 2.1 TX小鼠脾組織病理形態(tài)特點及變化42-44
• 2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)肝豆湯治療TX小鼠脾組織內(nèi)CD~（4+）、CD~（8+）及CD~（4+）/ CD~（8+）的表達(dá)44-45
• 2.3 Western-Blot法檢測經(jīng)肝豆湯治療TX小鼠脾組織內(nèi)IL-8、IL-18 的蛋白定量表達(dá)45-47
• 2.4 經(jīng)肝豆湯治療TX小鼠脾臟微量元素的變化47-48
• 3 討論48-57
• 3.1 WD模型TX小鼠建立依據(jù)48-49
• 3.2 TX小鼠脾臟形態(tài)學(xué)變化及其機制49-51
• 3.3 肝豆湯對TX小鼠脾臟免疫功能的影響及調(diào)節(jié)機制51-54
• 3.4 肝豆湯對TX小鼠脾臟微量元素的影響54-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-68
• 綜述68-76
• 參考文獻(xiàn)73-76
• 致謝76-77
• 個人簡介77

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：926045