本文關(guān)鍵詞：新生大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化、培養(yǎng)及鑒定

  更多相關(guān)文章： 小膠質(zhì)細(xì)胞 分離 培養(yǎng) 鑒定 帕金森病

【摘要】：目的：探討原代小膠質(zhì)細(xì)胞純化分離培養(yǎng)的方法,從而建立一種簡(jiǎn)易的、高產(chǎn)量的、高純度的連續(xù)獲得小膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型,同時(shí)建立小膠質(zhì)細(xì)胞活化的模型,為小膠質(zhì)細(xì)胞移植治療帕金森病的相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供足夠細(xì)胞材料。方法：1.混合膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)：取新生1-2d SD大鼠,酒精浸泡消毒,斷頭處死,冷D-Hanks反復(fù)沖洗,顯微鏡下取兩側(cè)大腦半球,剔除腦膜、血管,剪碎腦組織,加入胰蛋白酶消化,再加入DMEM/F12終止消化,過濾,離心,棄上清液,重新制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至10×105/ml接種于3個(gè)預(yù)先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中,隨機(jī)分成A、B、C三組,同一恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),24h后完全換液,3d換液1次,半量換液。2.小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化：待混合培養(yǎng)第7-9d,將隨機(jī)分成的三組細(xì)胞分離純化,A組：恒溫振蕩法；B組：溫和胰酶消化法；C組：利多卡因分離法。加入培養(yǎng)基重新吹打成細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞存活率,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml接種于預(yù)先放有蓋玻片(多聚賴氨酸包被)的相應(yīng)A、B、C三個(gè)6孔培養(yǎng)板中,30min后完全換液一次,去除未貼壁細(xì)胞,再加入新培養(yǎng)液,放入同一恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)。24h后完全換液,3d換液1次。3小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定：待分離純化繼續(xù)培養(yǎng)9d后,再利用CDllb (0X42)免疫熒光染色對(duì)分離純化的小膠質(zhì)細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定。4.脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞：收集原代小膠質(zhì)細(xì)胞接種于標(biāo)記6孔培養(yǎng)板。1、3、5分為A組,加入DMEM/F12培養(yǎng)液,作為對(duì)照組；2、4、6孔分為B組,加入預(yù)先加入了脂多糖的DMEM/F12培養(yǎng)液,于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察。結(jié)果：1.混合膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)：顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1～2d,混合膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量變化不大。小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較大,有許多細(xì)胞碎片。3～4d,星形膠質(zhì)細(xì)胞分裂進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,逐漸成層。小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量無明顯改變,但胞體明顯增大,折光性變化更為明顯,但折光性不均。5～6d,星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目持續(xù)增多,形成較明顯的底層,而同期小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目也出現(xiàn)明顯的增多,均勻分布于上層,形態(tài)呈圓形阿米巴樣。7～9d,細(xì)胞分層明顯,細(xì)胞數(shù)量變化不大。2小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化存活率檢測(cè)：三種方法分離純化后,離心收集小膠質(zhì)細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率分別為：A組：(92.58±2.62)%,B組：(93.61±1.62)%,C組：(92.97±1.54)%。3小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化鑒定：CD11b(OX42)免疫熒光染色小膠質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定分別為：A1組：(90.73±0.36)%,B1組：(96.19±3.31)%,Cl組：(97.63±2.28)%,A2,B2,C2陰性對(duì)照無特異性染色。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),分離純化第1d小膠質(zhì)細(xì)胞呈圓形阿米巴樣,基本無改變,繼續(xù)培養(yǎng)3-5d,小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸出現(xiàn)突起,且可見少量分支狀小膠質(zhì)細(xì)胞,培養(yǎng)7～9d時(shí)部分細(xì)胞轉(zhuǎn)為靜息狀態(tài)。4.脂多糖刺激后,小膠質(zhì)細(xì)胞處于激活狀態(tài)的數(shù)目明顯增多,炎癥因子釋放增多。結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)觀察到了小膠質(zhì)細(xì)胞的兩種形態(tài),并發(fā)現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中,其形態(tài)是先激活(阿米巴樣)再靜息(分支狀)的。2.本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)三種純化分離方法的對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)利多卡因分離法、溫和胰酶消化法獲得細(xì)胞數(shù)及純度均高于恒溫振蕩法,因此應(yīng)在與小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究工作中得到推廣,本實(shí)驗(yàn)也為研究小膠質(zhì)細(xì)胞功能奠定了基礎(chǔ)。3.本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD11b(OX42)免疫細(xì)胞熒光染色結(jié)果均呈陽性,且純度均較高,證明本實(shí)驗(yàn)方法能在體外培養(yǎng)出高純度的小膠質(zhì)細(xì)胞。4.本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠被脂多糖誘導(dǎo)激活釋放炎癥及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,證明此種方法培養(yǎng)的MG生物活性得以保留,可以建立活化模型。
【關(guān)鍵詞】：小膠質(zhì)細(xì)胞 分離 培養(yǎng) 鑒定 帕金森病
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 符號(hào)說明11-13
• 引言13-18
• 材料與方法18-27
• 1. 材料18-20
• 1.1 主要儀器設(shè)備18-19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 1.4 主要溶液配制19-20
• 2. 方法20-27
• 2.1 混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察20-22
• 2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化22-24
• 2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)24
• 2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定24-25
• 2.5 小膠質(zhì)細(xì)胞活化模型的建立25-26
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理26-27
• 結(jié)果27-41
• 1 混合膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)27-29
• 2 小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化29-32
• 3 細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞拒染實(shí)驗(yàn)32-34
• 4 免疫熒光染色鑒定34-36
• 5 小膠質(zhì)細(xì)胞活化模型分析36-41
• 討論41-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 文獻(xiàn)綜述53-62
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 論文發(fā)表情況62-63
• 致謝63

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 黃丹宇;葉民;;小膠質(zhì)細(xì)胞與帕金森病(英文)[J];中國(guó)組織工程研究;2012年24期

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本文編號(hào)：853417