本文關(guān)鍵詞：腦白質(zhì)損傷模型LINGO-1動態(tài)變化及低表達(dá)LINGO-1的OPCs移植初探

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【摘要】：背景腦白質(zhì)損傷(White matter injury, WMI)是早產(chǎn)兒腦損傷的常見形式,也是造成兒童腦癱和智障的主要病因之一。隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)的發(fā)展和完善,雖然使早產(chǎn)兒的存活率大大提高,但是目前國內(nèi)外對于早產(chǎn)兒WMI仍缺乏有效的治療方法。我國每年新增很多遺留腦癱或者認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)能力低下等后遺癥的患兒,給社會和家庭都帶來了極大的負(fù)擔(dān)。WMI發(fā)病的主要原因是由于腦內(nèi)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyte Precursor Cells, OPCs)在氧自由基、炎性因子等有害因素攻擊下受到一定損傷,導(dǎo)致腦白質(zhì)髓鞘化延遲或被破壞；少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocyte, OL)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)的成髓鞘細(xì)胞,由OPCs分化而來,OL可包繞神經(jīng)纖維的軸突而形成髓鞘。WMI患者由于內(nèi)源性成髓鞘細(xì)胞前體細(xì)胞(OPCs)大量丟失而出現(xiàn)髓鞘化障礙,要促進(jìn)其髓鞘再生,最有效、最直接的方法是植入外源性成髓鞘細(xì)胞。成熟的OL由于喪失了遷移能力而不適合作為移植的種子細(xì)胞,而OPCs因其是CNS中成髓鞘細(xì)胞的天然前體細(xì)胞,故可作為WMI治療的最佳種子細(xì)胞。盡管OPCs給WMI患者的治療帶來了新的希望,但是目前OPCs移植治療WMI還存在許多難題,其中影響WMI患者髓鞘再生的主要問題是外源植入OPCs的分化效率極低,難以促進(jìn)髓鞘再生；移植細(xì)胞OPCs作為一種外源物質(zhì),微環(huán)境對其存活分化極為重要,近年來研究發(fā)現(xiàn)了多種負(fù)性調(diào)節(jié)物質(zhì)對OPCs分化及髓鞘化產(chǎn)生了重要的影響,LINGO-1就是其中的典型代表之一。LINGO-1是一個由LRRN6A基因表達(dá)的614個氨基酸組成的跨膜蛋白,特異性表達(dá)于CNS的OL和神經(jīng)元。近年來動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),LINGO-1在OPCs分化和髓鞘形成過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,且LINGO-1是一個關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)因素,神經(jīng)元軸突和OPCs中LINGO-1表達(dá)下調(diào)是體內(nèi)髓鞘化所必需的。但是目前關(guān)于LINGO-1對于人源OPCs的存活及分化作用還尚未見報道。綜上所述,早產(chǎn)兒WMI治療的關(guān)鍵是促進(jìn)其髓鞘再生,外源植入OPCs將會是最直接有效的方法；然而目前影響髓鞘再生的主要問題是外源植入OPCs的存活及分化效率低,而LINGO-1可能是突破這一瓶頸問題的關(guān)鍵因素之一。本文旨在通過建立3日齡新生SD大鼠缺氧缺血性WMI模型,并探究造模后不同時間窗LINGO-1的動態(tài)變化情況,同時構(gòu)建人源LINGO-1慢病毒干擾載體,將經(jīng)過慢病毒干擾后低表達(dá)LINGO-1的人源OPCs移植入WMI模型中,對細(xì)胞植入后存活,遷移及分化情況進(jìn)行初步探究。第一章3日齡新生SD大鼠缺氧缺血性WMI模型的建立及其LINGO-1動態(tài)變化研究目的建立3日齡新生SD大鼠缺氧缺血性WMI模型并探究其LINGO-1動態(tài)變化情況。方法3日齡新生SD大鼠共計(jì)84只,隨機(jī)分為2個組：模型組(White matter injury,WMI組；n=42只),采用結(jié)扎右側(cè)頸總動脈聯(lián)合缺氧的方法建立缺氧缺血性WMI模型,假手術(shù)組(Sham-operated group, Sham組,n=42只),僅分離右側(cè)頸總動脈不作結(jié)扎處理,兩組動物再分別根據(jù)不同時間窗(1天、3天、7天、14天、21天、28天)隨機(jī)分為6個亞組,每組n=6只；WMI組和Sham組分別隨機(jī)抽取6只用于模型鑒定,通過腦組織病理形態(tài)變化、髓鞘堿性蛋白MBP損傷程度以及早期運(yùn)動功能障礙評估三個方面對模型進(jìn)行鑒定,并從不同時間窗探究造模后LINGO-1蛋白動態(tài)表達(dá)情況。結(jié)果1.造模7天后I-IE染色結(jié)果：Sham組無細(xì)胞腫脹、壞死病理改變,WMI組手術(shù)側(cè)整個大腦皮層下白質(zhì)較Sham組細(xì)胞,細(xì)胞稀疏、胞體腫脹、間隙增寬、排列紊亂,并可見微小梗死灶,整體呈現(xiàn)選擇性白質(zhì)損傷,染色結(jié)果與早產(chǎn)兒WMI病理學(xué)特征類似。2.免疫組化染色MBP表達(dá)情況：WMI組手術(shù)側(cè)白質(zhì)區(qū)外囊和與之垂直的突起髓鞘明顯丟失；Sham組手術(shù)側(cè)白質(zhì)沒有明顯髓鞘丟失。3.不同時間窗LINGO-1動態(tài)表達(dá)情況：造模后不同時間窗的qPCR結(jié)果顯示：WMI組動物造模1天后,LINGO-1 mRNA相對表達(dá)量較Sham組即開始明顯增高(3.79±0.30),并于7天時相對表達(dá)量達(dá)峰值(6.64±0.25),此后開始呈逐漸下降趨勢,21天時相對表達(dá)量較高峰期己大幅下降(2.57±0.47),三個時間點(diǎn)與Sham組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。至28天時WMI組表達(dá)已基本接近Sham組,與Sham組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。Western blot結(jié)果也得到相同結(jié)論,LINGO-1表達(dá)量上調(diào)的最高峰于WMI造模后7天出現(xiàn),且表達(dá)量總體變化趨勢與qPCR結(jié)果基本相同。4.早期運(yùn)動功能障礙評估：斜坡試驗(yàn)評分：WMI組左側(cè)肢體(結(jié)扎動脈對側(cè))均出現(xiàn)輕度的運(yùn)動功能障礙,斜坡試驗(yàn)檢測評分結(jié)果,WMI組和Sham組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.05。結(jié)論成功建立3日齡新生SD大鼠缺氧缺血性WMI模型,病理學(xué)及行為學(xué)改變與早產(chǎn)兒WMI臨床特征相似；造模后LINGO-1蛋白動態(tài)變化呈規(guī)律性、病理性升高,且于造模后7天達(dá)峰值。第二章人源LINGO-1慢病毒干擾載體的構(gòu)建與鑒定目的 體外構(gòu)建人源LINGO-1特異性慢病毒干擾載體,并測定其對靶基因LINGO-1的干擾效率,篩選出干擾效率最高的慢病毒干擾序列。方法 根據(jù)GenBank報道的人源LINGO-1基因序列,設(shè)計(jì)合成3對針對人源LINGO-1 shRNA的干擾序列,分別對應(yīng)shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組,同時設(shè)計(jì)一條陰性對照序列shRNA4組(無靶向隨機(jī)打散序列),克隆至重組質(zhì)粒載體并進(jìn)行基因測序,驗(yàn)證重組載體序列與合成的干擾載體框架是否一致；將測序正確的質(zhì)粒載體在293T細(xì)胞內(nèi)包裝成慢病毒并測定各組病毒原液滴度。體外培養(yǎng)人膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞U251,經(jīng)各組慢病毒載體轉(zhuǎn)染后,計(jì)算轉(zhuǎn)染效率,并通過免疫熒光染色、qPCR和Western blot檢測各組慢病毒載體的干擾效率。結(jié)果1.重組載體測序、包裝及滴度測定：構(gòu)建的慢病毒干擾載體經(jīng)基因測序儀測序,結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全一致,說明含所設(shè)計(jì)干擾序列的載體構(gòu)建成功；質(zhì)粒載體經(jīng)過包裝后均獲得了較高滴度的病毒原液,各組病毒原液滴度分別為shRNA1組=4E+8TU/ML、shRNA2組=2E+8TU/ML、shRNA3組=1E+8TU/ML、shRNA4組=3E+8TU/ML。2.免疫熒光染色結(jié)果：病毒載體感染人膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞U251后,各組GFP陽性細(xì)胞數(shù)高達(dá)96%以上。進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光染色,其中shRNA3組細(xì)胞較其它組免疫熒光呈現(xiàn)減弱現(xiàn)象,可間接說明shRNA3序列慢病毒干擾載體干擾LINGO-1蛋白效果明顯。3.qPCR結(jié)果：慢病毒載體感染的各組U251細(xì)胞中LINGO-1 mRNA相對表達(dá)量為：shRNA1組=0.88±0.03、shRNA2組=0.31±0.02、shRNA3組=0.18±0.03、shRNA4組=1.00±0.00,其中shRNA3組LINGO-1 mRNA相對表達(dá)量較其它組明顯降低,與shRNA4組比較,p0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即shRNA3組mRNA相對shRNA4組降低了82%。4.Western blot結(jié)果：灰度掃描結(jié)果顯示,各組LINGO-1蛋白表達(dá)量較對照組明顯降低,其中shRNA3組(shRNA3=0.28±0.03)蛋白表達(dá)量較其它組最少,與shRNA4 (shRNA4=1.00±0.00)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,p0.01；進(jìn)一步說明設(shè)計(jì)的各組干擾載體中shRNA3慢病毒干擾載體干擾效果最佳。結(jié)論我們成功構(gòu)建了人LINGO-1 shRNA慢病毒干擾載體,并篩選出了干擾效率載體最佳的載體,為后續(xù)試驗(yàn)及研究LINGO-1在軸突再生中的作用奠定了基礎(chǔ)。第三章低表達(dá)LINGO-1人源OPCs移植入腦白質(zhì)損傷模型初探目的探究低表達(dá)LINGO-1人源OPCs移植入WMI模型后存活、遷移及分化情況。方法利用人源神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells, NSCs)誘導(dǎo)獲得OPCs,利用免疫熒光染色鑒定OPCs特異性標(biāo)志物；將高純度OPCs經(jīng)shRNA3序列慢病毒(MOI=10)轉(zhuǎn)染后,計(jì)算GFP陽性細(xì)胞數(shù)；經(jīng)qPCR檢測其LINGO-1表達(dá)情況,驗(yàn)證其干擾效率。OPCs經(jīng)過轉(zhuǎn)染后,于WMI造模7天后進(jìn)行移植,OPCs經(jīng)立體定位移植,植入模型皮層下白質(zhì)區(qū),移植后分別于1、2、4周進(jìn)行灌注取腦,固定脫水后制作冠狀面冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的存活、遷移及分化情況；移植4周后根據(jù)細(xì)胞存活情況,取材進(jìn)行MBP染色判斷損傷白質(zhì)的改善程度。結(jié)果1.NSCs誘導(dǎo)獲得OPCs:神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)OPCs誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),獲得高純度OPCs, OPCs經(jīng)免疫熒光染色,其細(xì)胞亞群高表達(dá)OPCs的標(biāo)志物O4,PDGFaR和Sox10,僅有極少數(shù)細(xì)胞表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和神經(jīng)元標(biāo)志Tuj-1。2.OPCs轉(zhuǎn)染及干擾效率：誘導(dǎo)獲得的高純度OPCs經(jīng)含shRNA3序列的慢病毒轉(zhuǎn)染,熒光顯微鏡結(jié)果顯示GFP陽性細(xì)胞數(shù)高達(dá)98%以上。qPCR結(jié)果顯示：shRNA3序列慢病毒干擾載體有效降低OPCs LINGO-1表達(dá),干擾效率達(dá)84%。3.OPCs移植后情況：移植后1周移植動物模型灌注取腦制備冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察GFP標(biāo)記的移植細(xì)胞,結(jié)果顯示shRNA3'慢病毒OPCs移植組移植的細(xì)胞可在宿主腦組織中存活,細(xì)胞主要圍繞于注射針孔部位；shRNA4廈病毒OPCs移植組同樣可見移植細(xì)胞大量聚集在注射針孔部位；兩組移植細(xì)胞均未發(fā)生明顯的遷移。細(xì)胞移植2周后,移植動物模型采用相同的方法制備冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),shRNA3隉病毒OPCs移植組移植OPCs細(xì)胞依舊圍繞注射針孔附近,較一周時細(xì)胞有所位移,卻未發(fā)生明顯遷移現(xiàn)象,但細(xì)胞數(shù)量有所減少；shRNA4慢病毒OPCs移植組細(xì)胞明顯減少。移植后4周繼續(xù)觀察移植OPCs細(xì)胞的情況,多只同批移植模型鼠均未發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的OPCs細(xì)胞。結(jié)論成功將干擾效率最高的慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染入待移植OPCs,并干擾降低了OPCs的LINGO-1蛋白表達(dá)；移植后低表達(dá)LINGO-1的OPCs短期內(nèi)可以大量存活,但是長期存活存在障礙,且并未發(fā)生明顯的遷移分化。
【關(guān)鍵詞】：WMI LINGO-1 慢病毒載體 OPCs 細(xì)胞移植
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R742
【目錄】：

• 中文摘要3-9
• ABSTRCT9-18
• 前言18-22
• 第一章 3日齡SD大鼠缺氧缺血性WMI模型的建立及其LINGO-1動態(tài)變化研究22-35
• 1. 材料22-23
• 2. 方法23-28
• 3. 結(jié)果28-32
• 4. 討論32-33
• 5.小結(jié)33-35
• 第二章 人源LINGO-1慢病毒干擾載體的構(gòu)建與鑒定35-54
• 1. 材料35-36
• 2. 方法36-47
• 3. 結(jié)果47-51
• 4. 討論51-53
• 5 小結(jié)53-54
• 第三章 低表達(dá)LINGO-1人源OPCs移植入腦白質(zhì)損傷模型初探54-65
• 1. 材料54
• 2. 方法54-57
• 3. 結(jié)果57-61
• 4. 討論61-64
• 5.小結(jié)64-65
• 參考文獻(xiàn)65-73
• 附錄73-83
• 中英文對照縮略詞表83-84
• 碩士期間發(fā)表論文84-85
• 致謝85-86

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