發(fā)布時間：2017-09-13 16:14

  本文關(guān)鍵詞：電刺激小腦頂核誘導(dǎo)腦缺血大鼠未知miRNA的鑒定及功能分析

  更多相關(guān)文章： 電刺激小腦頂核 新的microRNA 深度測序 缺血/再灌注

【摘要】：早期的研究發(fā)現(xiàn)電刺激小腦頂核(fastigial nucleus stimulation, FNS)能夠啟動內(nèi)源性神經(jīng)保護作用,減輕局灶性腦缺血損傷,但其機制及具體途徑仍未闡明。新發(fā)現(xiàn)的微小RNA (microRNA, miRNA)作為一類重要的內(nèi)源性分子,其參與調(diào)控基因表達的重要意義為FNS的神經(jīng)保護機制研究提供了新的思路。前期我們采用高通量測序及芯片技術(shù)對電刺激小腦頂核1h后腦缺血大鼠的腦組織進行miRNA的表達譜分析,提示差異表達的miRNA可能通過靶向調(diào)控相關(guān)基因在預(yù)電刺激小腦頂核的大鼠中發(fā)揮腦保護作用。本研究主要對這些未知的miRNA序列進行鑒定和分析,并初步探索其在腦缺血神經(jīng)保護中的功能及其作用機制。第一部分電刺激小腦頂核誘導(dǎo)腦缺血大鼠未知miRNA的鑒定[目的]分析深度測序獲得的電刺激小腦頂核誘導(dǎo)腦缺血大鼠的未知miRNA序列,以篩選結(jié)構(gòu)典型、具有高度保守性的真正的miRNA。[方法]利用生物信息學(xué)方法,對前期深度測序獲得的原始序列數(shù)據(jù)進行分類注釋,根據(jù)miRNA的典型結(jié)構(gòu)特性及物種保守性篩選候選的新的miRNA;利用實時定量PCR的方法對新的miRNA進行表達驗證。[結(jié)果]經(jīng)比對,共鑒定出781個與哺乳類物種同源的未知的miRNA成熟序列。通過進一步的生物學(xué)特征分析,我們鑒定出一個新的miRNA(PC-3p-3469_406),結(jié)合miRNA的保守性特征,我們將其暫命名為rno-miR-676-1。 RT-PCR證實這個新的miR-676-1在肌肉和腦組織的表達量最高。[結(jié)論]mo-miR-676-1 (PC-3p-3469_406)是結(jié)構(gòu)典型、進化上具有保守性的新的miRNA。第二部分mo-miR-676-1在預(yù)電刺激小腦頂核后缺血再灌注損傷中的作用[目的]探討rno-miR-676-1在預(yù)電刺激小腦頂核后大鼠腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護作用機制。[方法](1)將SD雄性大鼠隨機分3組：①假手術(shù)組；②單純腦缺血組；③預(yù)電刺激組；RT-PCR檢測rno-miR-676-1在電刺激小腦頂核后局灶性腦缺血大鼠的差異表達情況。(2)通過側(cè)腦室注射rno-miR-676-1的類似物或抑制物進行體內(nèi)的過表達和抑制表達實驗,動物行為學(xué)評估神經(jīng)功能缺損情況、TTC染色測定梗死體積、TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡指數(shù),探討rno-miR-676-1在缺血損傷中的生物學(xué)功能。(3)生物信息軟件預(yù)測rno-miR-676-1的靶基因,雙熒光素酶報告系統(tǒng)基因檢測系統(tǒng)驗證rno-miR-676-1與靶基因的相互作用關(guān)系。[結(jié)果](1)與單純腦缺血再灌注損傷的大鼠相比,電刺激小腦頂核后腦缺血大鼠的rno-miR-676-1表達上調(diào)。(2) rno-miR-676-1上調(diào)后,腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀減輕、梗死體積減小、神經(jīng)元凋亡指數(shù)降低；而rno-miR-676-1表達下調(diào)后腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀加重、梗死體積增大、神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高。(3)軟件預(yù)測AUP1、CCNJ、PDPK1、BCL2L2和HRAS是rno-miR-676-1的靶基因,但雙熒光素酶報告系統(tǒng)顯示其3’UTR與rno-miR-676-1無明顯相互作用。[結(jié)論]電刺激小腦頂核后腦缺血大鼠的rno-miR-676-1表達上調(diào)。rno-miR-676-1上調(diào)在腦缺血再灌注過程中有保護性作用,表達下調(diào)則會加重腦缺血損傷。
【關(guān)鍵詞】：電刺激小腦頂核 新的microRNA 深度測序 缺血/再灌注
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 個人簡歷3-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-16
• 第一部分 電刺激小腦頂核誘導(dǎo)腦缺血大鼠未知miRNA的鑒定16-31
• 1.1 材料與方法16-22
• 1.1.1 實驗動物16
• 1.1.2 使用的數(shù)據(jù)庫及分析軟件16
• 1.1.3 主要的儀器和設(shè)備16-17
• 1.1.4 主要的試劑和試劑盒17-18
• 1.1.5 電刺激小腦頂核18
• 1.1.6 大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)線栓模型的制備18
• 1.1.7 深度測序18-19
• 1.1.8 小RNA的注釋分類19
• 1.1.9 預(yù)測新的miRNA19-20
• 1.1.10 Trizol法提取總RNA20
• 1.1.11 總RNA的質(zhì)量檢測20-21
• 1.1.12 RT-PCR檢測miRNA的表達水平21-22
• 1.1.13 統(tǒng)計學(xué)分析22
• 1.2 結(jié)果22-28
• 1.2.1 深度測序結(jié)果及其分析22-26
• 1.2.2 候選新的miRNA(PC-3p-3469_406)的生物學(xué)特征26-28
• 1.3. 討論28-31
• 第二部分 rno-miR-676-1在預(yù)電刺激小腦頂核后缺血再灌注損傷中的作用31-50
• 2.1 材料與方法31-38
• 2.1.1 實驗動物31
• 2.1.2 使用的數(shù)據(jù)庫及分析軟件31
• 2.1.3 主要的儀器和設(shè)備31-32
• 2.1.4 主要的試劑和試劑盒32-33
• 2.1.5 電刺激小腦頂核33
• 2.1.6 大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)線栓模型的制備33
• 2.1.7 神經(jīng)功能評分33-34
• 2.1.8 腦梗死體積比例測定34
• 2.1.9 側(cè)腦室注射34-35
• 2.1.10 RT-qPCR檢測miRNA的表達35
• 2.1.11 miRNA靶基因生物信息學(xué)預(yù)測35
• 2.1.12 miRNA/靶mRNA相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)驗證35-36
• 2.1.13 TUNEL染色36-37
• 2.1.14 統(tǒng)計學(xué)分析37-38
• 2.2. 結(jié)果38-47
• 2.2.1 miR-676-1在電刺激小腦頂核后缺血/再灌注大鼠的表達差異38
• 2.2.2 miR-676-1的生物學(xué)功能鑒定38-42
• 2.2.3 miR-676-1的靶基因鑒定42-47
• 2.3. 討論47-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-55
• 附錄1 候選新的miRNA前體及其回環(huán)結(jié)構(gòu)55-60
• 附錄2 構(gòu)建的表達載體的測序結(jié)果60-63
• 附錄3 英文縮略詞63-65
• 綜述 電刺激小腦頂核的神經(jīng)保護作用機制及其在腦缺血損傷中的臨床應(yīng)65-78
• 參考文獻73-78
• 致謝78-79
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文79

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 郭鋼花;李哲;樂林;關(guān)晨霞;;小腦頂核電刺激對腦卒中后抑郁及日常生活能力的影響[J];神經(jīng)損傷與功能重建;2008年04期

2 隆昱洲;雷進;羅麗華;尚正良;劉姚;;小腦頂核電刺激對腦梗死患者認(rèn)知功能的影響[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2013年03期

3 黃艷君;羅勇;;電刺激小腦頂核對大鼠局灶腦缺血再灌注后腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響[J];中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2008年03期

4 黃艷君;羅勇;;電刺激小腦頂核對成年大鼠局灶腦缺血/再灌注后腦內(nèi)Nestin表達的影響[J];中國康復(fù)理論與實踐;2007年08期

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本文編號：844707