本文關(guān)鍵詞：融合單鏈抗體AChRα1-scFv205靶向未成熟DC誘導(dǎo)免疫耐受預(yù)防EAMG的作用研究

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【摘要】：研究背景重癥肌無(wú)力(Myasthenia gravis,MG)是以波動(dòng)性和非正常的肌肉疲勞為特征的一類(lèi)自身免疫性疾病。自身抗體通過(guò)B細(xì)胞介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴(lài)、補(bǔ)體參與從而破壞神經(jīng)肌肉接頭。自身抗體主要包括抗乙酰膽堿受體(Acetylcholine receptor,ACh R)(85%病人)抗體、抗肌肉特異性激酶(Muscle-Specific Kinase,Musk)抗體和抗脂蛋白相關(guān)蛋白4(Lipoprotein-Related Protein 4,LRP4)抗體�？挂阴Ｄ憠A受體抗體陽(yáng)性型MG主要是乙酰膽堿受體的α1亞基的胞外域受到攻擊。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendtric cells,DCs)是目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)的體內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells,APC),其最大的特點(diǎn)就是表型和功能的靈活性。DCs吞噬、消化、呈遞外周抗原給外周器官淋巴結(jié)區(qū)的T細(xì)胞,激活共刺激分子CD40、CD80、CD86等引起免疫反應(yīng)。而未活化的DC,即未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(Immature dendritic cell,i DC)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell,treg)或T細(xì)胞無(wú)能等,導(dǎo)致抗原外周免疫耐受。DEC205是一種C型凝集素受體,在T細(xì)胞淋巴結(jié)區(qū)的DC上特異性表達(dá)。目前,基于i DC誘導(dǎo)免疫耐受的方法已用于各類(lèi)自身免疫性疾病的預(yù)防和治療。在以細(xì)胞免疫為主的自身免疫性疾病如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性甲狀腺炎和非肥胖性糖尿病動(dòng)物模型中,負(fù)載抗原或免疫優(yōu)勢(shì)肽段的未成熟髓源DC能有效預(yù)防抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。目的利用R97-116多肽免疫,建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力(Experiment autoimmune myasthenia gravis,EAMG)小鼠模型,并進(jìn)行評(píng)估;體外表達(dá)和純化sc Fv205和ACh Rα1 97-116蛋白,以及二者融合蛋白ACh Rα1-sc Fv205,并進(jìn)一步分析ACh Rα1-sc Fv205融合蛋白與DC的結(jié)合能力和生物學(xué)活性。最后研究ACh Rα1-sc Fv205對(duì)EAMG模型發(fā)病狀況的影響,并探討其中相關(guān)分子機(jī)制。方法1.利用R97-116多肽混合弗氏佐劑免疫小鼠,經(jīng)三次免疫后觀(guān)察其癥狀和體征,測(cè)定抗R97-116和抗ACh Rα1亞基抗體濃度,評(píng)價(jià)EAMG建模效果。2.構(gòu)建和表達(dá)融合單鏈抗體ACh Rα1-sc Fv205以及非融合的sc Fv205和ACh Rα197-116片段。體外培養(yǎng)小鼠骨髓源性的i DC,利用顯微鏡和掃描電鏡觀(guān)察其形態(tài)變化,流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測(cè)其表面共刺激分子和特異性標(biāo)志分子,分析i DC的免疫表型;流式和免疫熒光檢測(cè)ACh Rα1-sc Fv205與DC的親和力。分別在融合單鏈抗體給予小鼠的第1、21d,MACS分選脾CD11C+DC以及R97-116特異性的CD4+T細(xì)胞,MTT法檢測(cè)ACh Rα1-sc Fv205對(duì)R97-116特異性CD4+T細(xì)胞增殖活性的影響。3.利用EAMG小鼠模型確定ACh Rα1-sc Fv205是否可以預(yù)防EAMG發(fā)病。FCM檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)的比例變化和DC表型。ELISA檢測(cè)DC分泌IL-10及TGF-β的水平,以及小鼠血清中抗小鼠Ach Rα1亞基抗體濃度。結(jié)果1.通過(guò)每一月一次皮下注射R97-116及弗氏佐劑,3個(gè)月后,發(fā)現(xiàn)50%的小鼠出現(xiàn)震顫、弓背、肌力下降、體重降低等肌無(wú)力癥狀,ELISA結(jié)果顯示,小鼠血清中存在較高濃度的抗R97-116和抗ACh Rα1亞基抗體,表明成功建立了EAMG小鼠模型。2.分別構(gòu)建sc Fv205和ACh Rα1 97-116,以及ACh Rα1-sc Fv205融合表達(dá)的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染大腸桿菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE和Western-bolt結(jié)果顯示:相對(duì)應(yīng)的大小位置處有目的條帶。采用Ni2+-NTA柱,成功分離純化了sc Fv205、ACh Rα1 97-116大小位置處和ACh Rα1-sc Fv205大小位置處融合蛋白,初步測(cè)定純度為75%。分離小鼠骨髓細(xì)胞,經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng),細(xì)胞的形態(tài)符合DC特征,且經(jīng)LPS誘導(dǎo)后共刺激分子CD40、CD80、CD86表達(dá)水平增加。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ACh Rα1-sc Fv205、sc Fv205及ACh Rα1 97-116對(duì)i DC的親和力分別為41.4%、43.2%和7.0%,表明sc Fv205與DC之間具有特異性的結(jié)合能力。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,ACh Rα1-sc Fv205可以特異性的結(jié)合到脾臟中CD11C+細(xì)胞。分離融合單鏈抗體給予小鼠24h后脾臟的DC,發(fā)現(xiàn)ACh Rα1-sc Fv205可以靶向結(jié)合到DC,并刺激R97-116特異性CD4+T細(xì)胞增殖。分離融合單鏈抗體給予小鼠21天后脾臟的DC,發(fā)現(xiàn)ACh Rα1-sc Fv205并不能刺激R97-116特異性CD4+T細(xì)胞增殖。這些結(jié)果說(shuō)明:ACh Rα1-sc Fv205能夠特異性結(jié)合DC細(xì)胞,并誘導(dǎo)相關(guān)的免疫耐受反應(yīng)。3.在EAMG小鼠模型中,預(yù)防性給予ACh Rα1-sc Fv205,能夠明顯降低EAMG發(fā)病率。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示,給予ACh Rα1-sc Fv205的小鼠體內(nèi)ACh Rα1亞基抗體濃度明顯低于單獨(dú)給予ACh Rα1 97-116和sc Fv205(P0.05)。此外,ACh Rα1-sc Fv205能夠維持DC未成熟表型,增加小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例,促進(jìn)DC分泌IL-10和TGF-β。結(jié)論成功構(gòu)建了EAMG小鼠動(dòng)物模型,并獲得了ACh Rα1-sc Fv205融合蛋白,研究結(jié)果顯示ACh Rα1-sc Fv205融合蛋白能夠特異性地結(jié)合到體內(nèi)脾臟DC,并維持其未成熟表型,刺激產(chǎn)生IL-10、TGF-β等抑制性免疫因子,誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg細(xì)胞,降低體內(nèi)自身抗體。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示ACh Rα1-sc Fv205融合蛋白能夠抑制EAMG發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：單鏈抗體 未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞 DEC-205 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力 免疫耐受
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R746.1
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-24
• 第一部分 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力（EAMG）小鼠模型的建立和評(píng)價(jià)24-30
• 0 引言24
• 1 材料24-25
• 2 方法25-26
• 3 結(jié)果26-28
• 4 討論28-30
• 第二部分 AChRα1-scFv205融合蛋白的表達(dá)純化和生物學(xué)活性檢測(cè)30-49
• 0 引言30
• 1 材料30-33
• 2 方法33-39
• 3 結(jié)果39-46
• 4 討論46-49
• 第三部分 AChRα1-scFv205預(yù)防EAMG小鼠發(fā)病及其機(jī)制研究49-60
• 0 引言49
• 1 材料49-50
• 2 方法50-52
• 3 結(jié)果52-56
• 4 討論56-60
• 小結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-70
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果70-71
• 致謝71

【相似文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：823298