本文關鍵詞：PINK1對α-Synuclein誘導的線粒體功能障礙的保護作用

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【摘要】：帕金森疾病(Parkinson’s Disease,PD)是一種常見的漸進性神經退化疾病,主要以大腦黑質漸進性的丟失多巴胺能神經元為特征。其主要癥狀是運動功能的改變,如運動遲緩、靜止性震顫、步態(tài)畸形和姿勢不穩(wěn)等病變。此外,非運動功能也受到了影響,如嗅覺喪失、便秘、抑郁、幻覺、睡眠障礙、認知功能下降。突觸核蛋白(α-Synuclein,αS)的突變與顯性家族性帕金森疾病相關,PINK1突變可以影響線粒體質量控制系統(tǒng)引發(fā)隱性家族性帕金森疾病。線粒體的功能障礙是帕金森疾病共同的發(fā)病病理機制,在散發(fā)性和家族性帕金森疾病中已經證實αS可以影響線粒體的損傷。αS是被研究證實與家族性帕金森疾病有關的第一個致病基因。有關帕金森疾病家族遺傳史的研究都涉及到αS的基因改變,如基因突變和基因復制。目前αS蛋白總共有六個已知的氨基酸亞基突變與家族性帕金森疾病有關,即A30P,A53T,E46K,H50Q,G51D和A53E。盡管目前的研究發(fā)現(xiàn)某些突變可增加αS形成原纖維的傾向,并且這種低聚物的αS可能以多種方式發(fā)揮神經毒性作用,但是αS導致神經元死亡的確切機制還需要進一步的探索。此外,研究證實αS介導的神經元死亡可能是由多種機制而非單獨機制引起的。如野生型αS可以調節(jié)多巴胺神經遞質的傳遞,但是此功能的損失會導致帕金森疾病中多巴胺神經元的功能障礙或變性。此外,體外實驗表明,過表達αS可影響線粒體結構和復合體I的活性,同時也伴隨著活性氧的產生。在這些過表達αS的神經細胞模型中,研究發(fā)現(xiàn)αS可以從一個細胞傳遞到另一個細胞的現(xiàn)象。體內實驗表明對紋狀體進行局部注射αS纖維的小鼠大腦的許多區(qū)域均可觀察到αS的病理性傳播,并最終導致了黑質多巴胺能神經元的死亡。后續(xù)的研究表明αS細胞與細胞之間的傳播機制類似于朊病毒的傳播。PINK1是神經保護性激酶,具有維持線粒體復合體I活性和監(jiān)測整個線粒體完整性的功能。線粒體質量控制系統(tǒng)可以調節(jié)正常線粒體中PINK1的蛋白降解,并且使PINK1選擇性的聚集在受損線粒體的表面。膜內電位差作為能量源驅動PINK1進入到正常線粒體的內膜。在內膜上,PINK1被線粒體加工肽酶和早老素相關菱形蛋白酶裂解,裂解產物被運回細胞質隨后被蛋白酶體所降解。去極化的線粒體膜電位降低而不能驅動PINK1進入線粒體內膜,因此導致pink1在線粒體外膜上大量聚集。依賴膜電位的pink1剪切和后續(xù)降解機制確保了唯有去極化的線粒體才能夠聚集pink1。因此,pink1起到了選擇性標記受損線粒體的作用。pink1/parkin誘導的線粒體自噬是清除損傷線粒體的質量控制途徑。pink1作用在parkin的上游以觸發(fā)線粒體自噬過程。pink1不僅參與了線粒體自噬的過程還可以調節(jié)線粒體復合體i活性和維持神經元活性。pink1在線粒體自噬以及與自噬無關的活動中均以激酶依賴性的方式發(fā)揮作用。pink1可以磷酸化線粒體hsp90家族分子伴侶trap1,線粒體膜間隙蛋白酶htra2/omi和線粒體復合體i亞基ndufa10。pink1可使線粒體復合體i亞基ndufa10絲氨酸磷酸化,用以調節(jié)線粒體復合體i的活性。ndufa10的過表達可以恢復復合體i活性并能拯救pink1基因缺陷型的蒼蠅和成纖維細胞的表型。pink1對ndufa10活性的調節(jié)是獨立于線粒體自噬進行的,因為沉默ndufa10并不會影響細胞的線粒體自噬。pink1聚集在去極化線粒體表面,可以將線粒體外膜上的泛素磷酸化。磷酸化的泛素可以促使parkin招募到線粒體外膜上,同時parkin也被pink1所磷酸化。pink165位絲氨酸發(fā)生磷酸化后強力激活了e3連接酶parkin的活性,引起一些線粒體外膜蛋白發(fā)生磷酸化,包括線粒體融合蛋白,tom20,tom4,tom70和omp25。定量蛋白質組學和活細胞成像的研究表明,pink1可使線粒體上的泛素磷酸化和蛋白泛素鏈多磷酸化。受損線粒體廣泛的泛素化最終引發(fā)了線粒體的自噬反應,從而清除了損傷的線粒體。這個機制解釋了依賴pink1的parkin從細胞質到線粒體表面的募集過程,線粒體的去極化和錯誤折疊蛋白積累也可以誘導parkin的募集。活性氧作為正常呼吸的副產物主要是由線粒體產生的。線粒體的功能發(fā)生障礙往往會引起活性氧的產量增加,增加的活性氧對細胞的生存具有一定的危害。細胞具有各種抗氧化酶和還原型谷胱甘肽,因此具有一定的抗氧化能力。細胞的抗氧化能力可以清除活性氧,使細胞可以在一定水平的活性氧自由基環(huán)境中存活。若活性氧的水平超過細胞的抗氧化能力,細胞就會出現(xiàn)氧化壓力狀態(tài)。氧化壓力狀態(tài)的長時間持續(xù)會損傷蛋白質,脂類和核酸進而導致細胞死亡。線粒體功能障礙造成了較高水平的氧化壓力狀態(tài),由此引起了有害的生化改變,如增加的線粒體dna突變和減少的膜電位。組織炎癥產生的活性氧會對氨基酸進行化學修飾,還可以通過改變蛋白質的功能、結構和抗原性,影響細胞存活并可能涉及到炎癥相關的帕金森疾病。本課題目標是研究αS過表達對線粒體功能的影響以及PINK1在保護αS誘導的線粒體功能障礙中的重要性。對PINK1保護作用的研究是基于最近的研究成果確立的,它表明PINK1基因缺陷的小鼠更容易受到αS誘導的神經元毒性傷害。由于PINK1具有維持線粒體質量控制體系的作用,因此我們研究PINK1缺失是否會加劇αS誘導的線粒體缺陷。為研究線粒體的功能變化,對過表達和不表達A53T-αS的野生型和PINK1敲除型小鼠胚胎成纖維細胞測定線粒體膜電位,活性氧和線粒體呼吸。盡管小鼠胚胎成纖維細胞在生理表現(xiàn)上不同于神經元細胞,但是許多帕金森疾病的相關研究都采用了小鼠胚胎成纖維細胞。因為小鼠胚胎成纖維細胞可以很容易地生長并可以通過永生化產生永久的細胞系。此外,線粒體在所有的細胞中都執(zhí)行著相同的功能,因此研究小鼠胚胎成纖維細胞的線粒體,對所有類型的細胞都具有代表性。不同的是,線粒體功能障礙對不同類型細胞的生存影響不同,神經元對線粒體的功能障礙是特別敏感的。本課題構建了編碼A53T-αS的慢病毒載體質粒,此質粒與編碼水皰性口炎病毒G蛋白VSV-G,HIV-gag/pol和Rev質粒共同轉染293T細胞以產生重組的逆轉錄病毒。用A53T-αS逆轉錄病毒感染預先經過SV40 large T永生化的野生型和PINK1敲除型小鼠胚胎成纖維細胞,通過流式細胞儀檢測技術和免疫化學檢測法來檢測感染后的小鼠胚胎成纖維細胞是否可以穩(wěn)定過表達A53T-αS。獲得穩(wěn)定表達的細胞系后,用獲得的細胞系來研究野生型和PINK1敲除型的小鼠胚胎成纖維細胞中線粒體功能以及活性氧的變化。此外,構建編碼氧化還原敏感性蛋白Ro-GFP,利用Ro-GFP在細胞內的定位對不同的細胞器進行活性氧測量。本課題結果表明,表達A53T-αS的PINK1敲出型小鼠胚胎成纖維細胞與野生型細胞相比具有顯著的線粒體功能障礙,如線粒體膜電位發(fā)生改變,細胞質內的活性氧含量增加,細胞剩余呼吸能力減弱�？傊�,這些結果表明PINK1缺失可能是通過加劇αS-A53T誘導的線粒體損傷和增加細胞質內活性氧從而引起神經元N失的增加。
【關鍵詞】：突觸核蛋白 PINK1 帕金森疾病 膜電位 氧化壓力 線粒體呼吸
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• CHAPTER 1 Introduction11-24
• 1.1 Parkinson’s disease11-13
• 1.2 α-Synuclein13-17
• 1.2.1 Lewy bodies13
• 1.2.2 α-Synuclein gene mutations linked with inherited PD13-14
• 1.2.3 α-Synuclein structure14-15
• 1.2.4 α-Synuclein and cytotoxicity15-17
• 1.3 PINK 1 and Parkin17-21
• 1.3.1 PINK 117-18
• 1.3.2 PINK1 and Parkin mediate mitophagy of damaged mitochondria18-20
• 1.3.3 Mitophagy-independent functions of PINK120-21
• 1.4 Reactive oxygen species (ROS)21
• 1.5 Complex I21-22
• 1.6 Purpose and main content22-24
• 1.6.1 Overall aim22
• 1.6.2 Main research contents22-24
• CHAPTER 2 Materials and Methods24-41
• 2.1 Reagents and Equipment24-25
• 2.1.1 Reagents24-25
• 2.1.2 Equipment25
• 2.2 Methods25-41
• 2.2.1 Molecular cloning25-31
• 2.2.2 Calcium phosphate transfection31-32
• 2.2.3 Western Blotting32-35
• 2.2.4 Immunocytochemistry35-36
• 2.2.5 Virus Packaging36
• 2.2.6 Infection36-37
• 2.2.7 Flow cytometry37-38
• 2.2.8 Mitochondrial respiration (Extracellular Flux Analyzer)38
• 2.2.9 Protein extraction38-40
• 2.2.10 Transmission Electron Microscopy40-41
• CHAPTER 3 Results and Discussion41-59
• 3.1 Construction of retroviral vectors encoding A53T-αS41
• 3.2 Cell culture and transfection41-42
• 3.3 Confirmation of α-Synuclein expression by Western blot42-43
• 3.4 Packaging of PTY-CMV-A53T-Syn virus43-44
• 3.5 Infection of MEFs with PTY-CMV-A53T-Syn virus44-45
• 3.6 Detection of A53T-αS expression in virus-transduced WT andPINK1-deficient MEFs with immunocytochemistry45-46
• 3.7 Quantification of A53T-αS expression by flow cytometry46-48
• 3.8 Measurement of mitochondrial membrane potential (Δψm) with flowcytometry48-49
• 3.9 Measurement of Δψm and mitochondrial mass in the same cells withconfocal microscopy49-50
• 3.10 Oxidative stress in cytoplasm and mitochondrial matrix of WT andPINK1-deficient MEFs expressing A53T-αS50-54
• 3.10.1 Generation of recombinant retroviruses for expression of cytosolicand mitochondria-targeted ro GFP50-52
• 3.10.2 Transduction of WT and PINK1-deficient MEFs with Cyto-ro GFPand Matrix-ro GFP retroviruses52-53
• 3.10.3 Measurement of cytoplasmic and mitochondrial oxidative stress(ROS) in Ro-GFP retrovirus-transduced MEFs53-54
• 3.11 Measurement of mitochondrial respiration with extracellular fluxanalysis54-56
• 3.12 Electron microscopy analysis of mitochondrial morphology56-57
• 3.13 Quantification of detergent-soluble and insoluble αS57-59
• Conclusions59-60
• Discussion60-63
• References63-71
• Acknowledgement71

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