本文關(guān)鍵詞：PINK1對(duì)α-Synuclein誘導(dǎo)的線粒體功能障礙的保護(hù)作用

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【摘要】：帕金森疾病(Parkinson’s Disease,PD)是一種常見的漸進(jìn)性神經(jīng)退化疾病,主要以大腦黑質(zhì)漸進(jìn)性的丟失多巴胺能神經(jīng)元為特征。其主要癥狀是運(yùn)動(dòng)功能的改變,如運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、步態(tài)畸形和姿勢(shì)不穩(wěn)等病變。此外,非運(yùn)動(dòng)功能也受到了影響,如嗅覺(jué)喪失、便秘、抑郁、幻覺(jué)、睡眠障礙、認(rèn)知功能下降。突觸核蛋白(α-Synuclein,αS)的突變與顯性家族性帕金森疾病相關(guān),PINK1突變可以影響線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)引發(fā)隱性家族性帕金森疾病。線粒體的功能障礙是帕金森疾病共同的發(fā)病病理機(jī)制,在散發(fā)性和家族性帕金森疾病中已經(jīng)證實(shí)αS可以影響線粒體的損傷。αS是被研究證實(shí)與家族性帕金森疾病有關(guān)的第一個(gè)致病基因。有關(guān)帕金森疾病家族遺傳史的研究都涉及到αS的基因改變,如基因突變和基因復(fù)制。目前αS蛋白總共有六個(gè)已知的氨基酸亞基突變與家族性帕金森疾病有關(guān),即A30P,A53T,E46K,H50Q,G51D和A53E。盡管目前的研究發(fā)現(xiàn)某些突變可增加αS形成原纖維的傾向,并且這種低聚物的αS可能以多種方式發(fā)揮神經(jīng)毒性作用,但是αS導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的確切機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索。此外,研究證實(shí)αS介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡可能是由多種機(jī)制而非單獨(dú)機(jī)制引起的。如野生型αS可以調(diào)節(jié)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞,但是此功能的損失會(huì)導(dǎo)致帕金森疾病中多巴胺神經(jīng)元的功能障礙或變性。此外,體外實(shí)驗(yàn)表明,過(guò)表達(dá)αS可影響線粒體結(jié)構(gòu)和復(fù)合體I的活性,同時(shí)也伴隨著活性氧的產(chǎn)生。在這些過(guò)表達(dá)αS的神經(jīng)細(xì)胞模型中,研究發(fā)現(xiàn)αS可以從一個(gè)細(xì)胞傳遞到另一個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明對(duì)紋狀體進(jìn)行局部注射αS纖維的小鼠大腦的許多區(qū)域均可觀察到αS的病理性傳播,并最終導(dǎo)致了黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡。后續(xù)的研究表明αS細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播機(jī)制類似于朊病毒的傳播。PINK1是神經(jīng)保護(hù)性激酶,具有維持線粒體復(fù)合體I活性和監(jiān)測(cè)整個(gè)線粒體完整性的功能。線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)正常線粒體中PINK1的蛋白降解,并且使PINK1選擇性的聚集在受損線粒體的表面。膜內(nèi)電位差作為能量源驅(qū)動(dòng)PINK1進(jìn)入到正常線粒體的內(nèi)膜。在內(nèi)膜上,PINK1被線粒體加工肽酶和早老素相關(guān)菱形蛋白酶裂解,裂解產(chǎn)物被運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)隨后被蛋白酶體所降解。去極化的線粒體膜電位降低而不能驅(qū)動(dòng)PINK1進(jìn)入線粒體內(nèi)膜,因此導(dǎo)致pink1在線粒體外膜上大量聚集。依賴膜電位的pink1剪切和后續(xù)降解機(jī)制確保了唯有去極化的線粒體才能夠聚集pink1。因此,pink1起到了選擇性標(biāo)記受損線粒體的作用。pink1/parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬是清除損傷線粒體的質(zhì)量控制途徑。pink1作用在parkin的上游以觸發(fā)線粒體自噬過(guò)程。pink1不僅參與了線粒體自噬的過(guò)程還可以調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體i活性和維持神經(jīng)元活性。pink1在線粒體自噬以及與自噬無(wú)關(guān)的活動(dòng)中均以激酶依賴性的方式發(fā)揮作用。pink1可以磷酸化線粒體hsp90家族分子伴侶trap1,線粒體膜間隙蛋白酶htra2/omi和線粒體復(fù)合體i亞基ndufa10。pink1可使線粒體復(fù)合體i亞基ndufa10絲氨酸磷酸化,用以調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體i的活性。ndufa10的過(guò)表達(dá)可以恢復(fù)復(fù)合體i活性并能拯救pink1基因缺陷型的蒼蠅和成纖維細(xì)胞的表型。pink1對(duì)ndufa10活性的調(diào)節(jié)是獨(dú)立于線粒體自噬進(jìn)行的,因?yàn)槌聊琻dufa10并不會(huì)影響細(xì)胞的線粒體自噬。pink1聚集在去極化線粒體表面,可以將線粒體外膜上的泛素磷酸化。磷酸化的泛素可以促使parkin招募到線粒體外膜上,同時(shí)parkin也被pink1所磷酸化。pink165位絲氨酸發(fā)生磷酸化后強(qiáng)力激活了e3連接酶parkin的活性,引起一些線粒體外膜蛋白發(fā)生磷酸化,包括線粒體融合蛋白,tom20,tom4,tom70和omp25。定量蛋白質(zhì)組學(xué)和活細(xì)胞成像的研究表明,pink1可使線粒體上的泛素磷酸化和蛋白泛素鏈多磷酸化。受損線粒體廣泛的泛素化最終引發(fā)了線粒體的自噬反應(yīng),從而清除了損傷的線粒體。這個(gè)機(jī)制解釋了依賴pink1的parkin從細(xì)胞質(zhì)到線粒體表面的募集過(guò)程,線粒體的去極化和錯(cuò)誤折疊蛋白積累也可以誘導(dǎo)parkin的募集�；钚匝踝鳛檎：粑母碑a(chǎn)物主要是由線粒體產(chǎn)生的。線粒體的功能發(fā)生障礙往往會(huì)引起活性氧的產(chǎn)量增加,增加的活性氧對(duì)細(xì)胞的生存具有一定的危害。細(xì)胞具有各種抗氧化酶和還原型谷胱甘肽,因此具有一定的抗氧化能力。細(xì)胞的抗氧化能力可以清除活性氧,使細(xì)胞可以在一定水平的活性氧自由基環(huán)境中存活。若活性氧的水平超過(guò)細(xì)胞的抗氧化能力,細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)氧化壓力狀態(tài)。氧化壓力狀態(tài)的長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)會(huì)損傷蛋白質(zhì),脂類和核酸進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。線粒體功能障礙造成了較高水平的氧化壓力狀態(tài),由此引起了有害的生化改變,如增加的線粒體dna突變和減少的膜電位。組織炎癥產(chǎn)生的活性氧會(huì)對(duì)氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾,還可以通過(guò)改變蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)和抗原性,影響細(xì)胞存活并可能涉及到炎癥相關(guān)的帕金森疾病。本課題目標(biāo)是研究αS過(guò)表達(dá)對(duì)線粒體功能的影響以及PINK1在保護(hù)αS誘導(dǎo)的線粒體功能障礙中的重要性。對(duì)PINK1保護(hù)作用的研究是基于最近的研究成果確立的,它表明PINK1基因缺陷的小鼠更容易受到αS誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性傷害。由于PINK1具有維持線粒體質(zhì)量控制體系的作用,因此我們研究PINK1缺失是否會(huì)加劇αS誘導(dǎo)的線粒體缺陷。為研究線粒體的功能變化,對(duì)過(guò)表達(dá)和不表達(dá)A53T-αS的野生型和PINK1敲除型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞測(cè)定線粒體膜電位,活性氧和線粒體呼吸。盡管小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在生理表現(xiàn)上不同于神經(jīng)元細(xì)胞,但是許多帕金森疾病的相關(guān)研究都采用了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。因?yàn)樾∈笈咛コ衫w維細(xì)胞可以很容易地生長(zhǎng)并可以通過(guò)永生化產(chǎn)生永久的細(xì)胞系。此外,線粒體在所有的細(xì)胞中都執(zhí)行著相同的功能,因此研究小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的線粒體,對(duì)所有類型的細(xì)胞都具有代表性。不同的是,線粒體功能障礙對(duì)不同類型細(xì)胞的生存影響不同,神經(jīng)元對(duì)線粒體的功能障礙是特別敏感的。本課題構(gòu)建了編碼A53T-αS的慢病毒載體質(zhì)粒,此質(zhì)粒與編碼水皰性口炎病毒G蛋白VSV-G,HIV-gag/pol和Rev質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以產(chǎn)生重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒。用A53T-αS逆轉(zhuǎn)錄病毒感染預(yù)先經(jīng)過(guò)SV40 large T永生化的野生型和PINK1敲除型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)和免疫化學(xué)檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)感染后的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞是否可以穩(wěn)定過(guò)表達(dá)A53T-αS。獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系后,用獲得的細(xì)胞系來(lái)研究野生型和PINK1敲除型的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中線粒體功能以及活性氧的變化。此外,構(gòu)建編碼氧化還原敏感性蛋白R(shí)o-GFP,利用Ro-GFP在細(xì)胞內(nèi)的定位對(duì)不同的細(xì)胞器進(jìn)行活性氧測(cè)量。本課題結(jié)果表明,表達(dá)A53T-αS的PINK1敲出型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比具有顯著的線粒體功能障礙,如線粒體膜電位發(fā)生改變,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的活性氧含量增加,細(xì)胞剩余呼吸能力減弱�？傊�,這些結(jié)果表明PINK1缺失可能是通過(guò)加劇αS-A53T誘導(dǎo)的線粒體損傷和增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)活性氧從而引起神經(jīng)元N失的增加。
【關(guān)鍵詞】：突觸核蛋白 PINK1 帕金森疾病 膜電位 氧化壓力 線粒體呼吸
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• CHAPTER 1 Introduction11-24
• 1.1 Parkinson’s disease11-13
• 1.2 α-Synuclein13-17
• 1.2.1 Lewy bodies13
• 1.2.2 α-Synuclein gene mutations linked with inherited PD13-14
• 1.2.3 α-Synuclein structure14-15
• 1.2.4 α-Synuclein and cytotoxicity15-17
• 1.3 PINK 1 and Parkin17-21
• 1.3.1 PINK 117-18
• 1.3.2 PINK1 and Parkin mediate mitophagy of damaged mitochondria18-20
• 1.3.3 Mitophagy-independent functions of PINK120-21
• 1.4 Reactive oxygen species (ROS)21
• 1.5 Complex I21-22
• 1.6 Purpose and main content22-24
• 1.6.1 Overall aim22
• 1.6.2 Main research contents22-24
• CHAPTER 2 Materials and Methods24-41
• 2.1 Reagents and Equipment24-25
• 2.1.1 Reagents24-25
• 2.1.2 Equipment25
• 2.2 Methods25-41
• 2.2.1 Molecular cloning25-31
• 2.2.2 Calcium phosphate transfection31-32
• 2.2.3 Western Blotting32-35
• 2.2.4 Immunocytochemistry35-36
• 2.2.5 Virus Packaging36
• 2.2.6 Infection36-37
• 2.2.7 Flow cytometry37-38
• 2.2.8 Mitochondrial respiration (Extracellular Flux Analyzer)38
• 2.2.9 Protein extraction38-40
• 2.2.10 Transmission Electron Microscopy40-41
• CHAPTER 3 Results and Discussion41-59
• 3.1 Construction of retroviral vectors encoding A53T-αS41
• 3.2 Cell culture and transfection41-42
• 3.3 Confirmation of α-Synuclein expression by Western blot42-43
• 3.4 Packaging of PTY-CMV-A53T-Syn virus43-44
• 3.5 Infection of MEFs with PTY-CMV-A53T-Syn virus44-45
• 3.6 Detection of A53T-αS expression in virus-transduced WT andPINK1-deficient MEFs with immunocytochemistry45-46
• 3.7 Quantification of A53T-αS expression by flow cytometry46-48
• 3.8 Measurement of mitochondrial membrane potential (Δψm) with flowcytometry48-49
• 3.9 Measurement of Δψm and mitochondrial mass in the same cells withconfocal microscopy49-50
• 3.10 Oxidative stress in cytoplasm and mitochondrial matrix of WT andPINK1-deficient MEFs expressing A53T-αS50-54
• 3.10.1 Generation of recombinant retroviruses for expression of cytosolicand mitochondria-targeted ro GFP50-52
• 3.10.2 Transduction of WT and PINK1-deficient MEFs with Cyto-ro GFPand Matrix-ro GFP retroviruses52-53
• 3.10.3 Measurement of cytoplasmic and mitochondrial oxidative stress(ROS) in Ro-GFP retrovirus-transduced MEFs53-54
• 3.11 Measurement of mitochondrial respiration with extracellular fluxanalysis54-56
• 3.12 Electron microscopy analysis of mitochondrial morphology56-57
• 3.13 Quantification of detergent-soluble and insoluble αS57-59
• Conclusions59-60
• Discussion60-63
• References63-71
• Acknowledgement71

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本文編號(hào)：785526