本文關(guān)鍵詞：基于PLGA膜與Necl-1蛋白構(gòu)建體外組織工程化神經(jīng)的研究

  更多相關(guān)文章： Necl-1 雪旺細胞 增殖 粘附 PLGA Necl-1 體外組織工程神經(jīng)

【摘要】：第一部分背景：目前周圍神經(jīng)缺損的治療效果尚不十分理想,研究組織工程神經(jīng)修復周圍神經(jīng)缺損得到許多關(guān)注,常用的種子細胞是雪旺細胞(SCs),但是現(xiàn)存的問題是其與支架材料的粘附力不足,影響了組織工程化神經(jīng)的構(gòu)建及其效果。如增加細胞與載體之間的粘附力,提高載體上的細胞數(shù)量,有望改善其效果。目的：研究Necl-1蛋白對體外培養(yǎng)的SCs的影響,觀察SCs的生物學特性,主要考察其對SCs增殖、粘附和形態(tài)維持作用及GDNF、BDNF和CNTF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響。方法：使用RSC96雪旺細胞進行體外培養(yǎng),擴增培養(yǎng)備用, MTT法測定不同濃度的Necl-1對SCs的影響,篩選出三個較佳濃度(25μ/ml, 50μg/ml,100μg/ml)。用篩出來的三個較佳濃度的Necl-1進一步干預SCs,不加Necl-1為對照,分別于2d、4d和6d,通過檢測細胞增殖、細胞活力FDA/PI熒光染色,蘇木精-伊紅染色,S-100b免疫組化測定及細胞RNA提取和實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)檢測GDNF、BDNF、CNTF、S-100b基因表達量,進一步考察Necl-1對SCs的促進作用。結(jié)果：MTT細胞毒性試驗結(jié)果顯示當Necl-1濃度為50μg/ml時,其對SCs的增殖促進作用最明顯,濃度為250μ/ml后開始出現(xiàn)抑制作用。細胞增殖實驗中,發(fā)現(xiàn)Necl-1各組在2d、4d、6d時所測MTT值均較對照組要高。細胞的FDA/PI熒光染色中Necl-1各組與空白對照組死活細胞比例差別不大。HE染色的結(jié)果顯示各組細胞形態(tài)上并沒有差異,但Necl-1各組在細胞密度方面較空白對照組大,且在濃度50μg/ml時達到最大。當Necl-1在濃度為50gg/ml時,分別在第4d、6d天的OD值相對較高。通過對SCs的S-100b免疫組化進行染色,發(fā)現(xiàn)Necl-1各組的SCs中S-100b陽性表達較對空白對照組相比有明顯增加,且50μg/ml濃度的Necl-1培養(yǎng)SCs,其S-100b表達量最大。在基因表達方面,發(fā)現(xiàn)Necl-1各組中GDNF、BDNF、CNTF、S-100b的表達量較對照組均有顯著上調(diào)。SCs在Necl-1濃度為50μg/ml下培養(yǎng)4d、6d時其GDNF、GDNF、S-100b的表達能力最強。而BDNF在2d時各組表達差異不大,但在4d時濃度為25μg/ml表現(xiàn)較為明顯的促進作用,6d則為50μg/ml有較強的促進作用。結(jié)論：實驗結(jié)果表明,適當濃度的Necl-1能促進SCs增殖和粘附,并能維持其細胞形態(tài),增強GDNF、BDNF和CNTF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達,為SCs參與外周神經(jīng)修復提供一個更為適宜的微環(huán)境。提示Necl-1為制備更為穩(wěn)定的組織工程神經(jīng)提供可能。第一部分背景：聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)是由乳酸和羥基乙酸兩種單體隨機聚合而成,是一種可降解的功能高分子有機化合物,具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能,因此是一種廣泛應用的組織工程神經(jīng)支架�；赑LGA膜材料并結(jié)合Necl-1蛋白構(gòu)建組織工程化神經(jīng),考察Necl-1對SCs的增殖粘附作用以及特異的錨定作用,探索制備組織工程神經(jīng)的新思路。目的：通過蛋白因子結(jié)合組織工程技術(shù),為周圍神經(jīng)修復提供新模型,檢測SCs的相關(guān)生物學特性,探究SCs經(jīng)Necl-1蛋白干預后在PLGA膜材料上的增殖及粘附情況。方法：將PLGA膜材料表層均勻涂上Necl-1蛋白,使其Necl-1化。在PLGA膜上種植SCs,在不同組問分別加入較佳濃度的Necl-1蛋白(25μg/ml、 50μg/ml、100μg/ml)進行試驗。分別于2d、4d和6d三個時間點測定MTT細胞增殖量,考察PLGA膜聯(lián)合Necl-1蛋白對SCs的增殖粘附作用的影響;通過FDA/PI, HE染色觀察不同濃度下SCs形態(tài)特性的變化；通過S-100b免疫組化試驗檢測SCs特異蛋白的表達水平。采用RT-PCR檢測相關(guān)基因GDNF、BDNF、CNTF、S-100b的表達。運用電子顯微鏡(SEM)觀察細胞在PLGA膜上生長情況及形態(tài)特征。結(jié)果：SCs能較好地粘附于PLGA膜材料上生長。MTT細胞增殖實驗在2、4、6d三個時間點上Necl-1各組均較空白對照組結(jié)果要好,尤其以N2(50μg/ml)濃度為最佳。細胞增殖實驗的結(jié)果顯示各組的OD值均較同期的無PLGA膜要高,其中N1、N2在4d、6d時間點上對細胞的增殖作用表現(xiàn)較好。通過HE染色觀察可知其細胞形態(tài)并沒有改變,Necl-1各組細胞在4、6d時成簇生長明顯。FDA/PI熒光染色檢測細胞活性,結(jié)果表明死活細胞比例方面空白組與藥物組差別不大。免疫組化方面,N2(50μg/ml)濃度下SCs的S-100b表達量相對較高。對于Necl-1組基因表達的情況,實驗得出無論GDNF、BDNF、CNTF、S-100b,其表達水平均大于空白對照組,隨著培養(yǎng)時間的延長其表達水平均有顯著上升,其中仍以N2(50μg/ml)濃度最強。掃描電子顯微鏡(SEM)的結(jié)果顯示PLGA二維支架接種SCs 2d、4d和6d后,細胞能較穩(wěn)定的粘附在支架表面鋪展生長,部分細胞可向膜內(nèi)嵌入生長。隨著時間的延長,粘附在支架上的細胞數(shù)量明顯增加。同時間點的N2(50μg/ml)組與空白對照組相比,N2組的細胞量明顯高于空白對照組,且N2組細胞表面有大量突觸形成。結(jié)論：結(jié)合Necl-1蛋白體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)更為穩(wěn)定和優(yōu)越,Necl-1蛋白有利于促進SCs在PLGA膜材料上增殖和粘附生長,對其表型及功能的維持有一定積極意義。基于PLGA和Necl-1蛋白體外構(gòu)建組織化神經(jīng)具有一定可行性,為進一步用于坐骨神經(jīng)缺損動物模型提過依據(jù)和參照。
【關(guān)鍵詞】：Necl-1 雪旺細胞 增殖 粘附 PLGA Necl-1 體外組織工程神經(jīng)
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 個人簡歷3-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-15
• 第一部分 Necl-1蛋白對雪旺細胞生物學特性的影響15-38
• 前言15-16
• 1 材料和方法16-25
• 2 結(jié)果25-31
• 3 討論31-34
• 4 結(jié)論34
• 5 參考文獻34-38
• 第二部分 基于PLGA和Necl-1蛋白構(gòu)建體外組織工程化神經(jīng)38-58
• 前言38-39
• 1 材料和方法39-43
• 2 結(jié)果43-48
• 3 討論48-51
• 4 結(jié)論51
• 5 參考文獻51-58
• 附錄58-59
• 綜述 生物材料修復周圍神經(jīng)損傷的研究進展59-68
• 參考文獻65-68
• 致謝68-69
• 攻讀碩士研究生期間發(fā)表的學術(shù)論文69-70
• 附件70-77

【參考文獻】

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本文編號：778961