本文關(guān)鍵詞：共抑制分子VISTA胞外段重組蛋白表達(dá)及其對(duì)EAE小鼠治療作用的研究

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【摘要】：研究背景:共刺激分子參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化/凋亡,其中負(fù)性共刺激分子(共抑制分子)能夠產(chǎn)生負(fù)性信號(hào),削弱、限制或中止免疫應(yīng)答,它可以誘導(dǎo)免疫耐受的形成并且維持外周耐受,從而阻止自體免疫發(fā)生。大量研究表明,共抑制分子在多發(fā)性硬化癥/實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎(MS/EAE)的病程中發(fā)揮重要的作用,是治療MS/EAE的潛在靶點(diǎn)。VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的共抑制分子,也被稱為PD-1H(Programmed death-1 homolog),屬于Ig超家族的成員之一。VISTA廣泛表達(dá)于造血細(xì)胞表面,在抗原呈遞細(xì)胞(APCs)及T細(xì)胞表面也有表達(dá),且VISTA無(wú)論表達(dá)在APCs上還是T細(xì)胞上,均表現(xiàn)出對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的抑制作用。已有研究證實(shí)VISTAKO 2D2轉(zhuǎn)基因小鼠的EAE發(fā)病程度、發(fā)病率均高于野生型2D2小鼠,表明VISTA會(huì)增加EAE自發(fā)的敏感性,與MS/EAE自身免疫疾病密切相關(guān)。為探討VISTA對(duì)EAE小鼠病情的影響,本研究在不同的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)VISTA胞外段重組蛋白并驗(yàn)證其活性;同時(shí)構(gòu)建EAE小鼠模型,研究VISTA基因的表達(dá)與EAE小鼠病程進(jìn)展的關(guān)系及VISTA胞外段重組蛋白對(duì)EAE小鼠病情的影響。研究方法:1、構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET22b-VISTA,表達(dá)并純化VISTA胞外段重組蛋白,使用CCK8法驗(yàn)證其對(duì)脾臟細(xì)胞的增殖的影響以驗(yàn)證其活性;2、構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒p PICZa A-VISTA,甲醇誘導(dǎo)VISTA胞外段重組蛋白的表達(dá);構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體p FUSE-VISTA-m Ig G2a,脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,瞬時(shí)表達(dá)重組蛋白,RT-PCR及Western Blot檢驗(yàn)重組蛋白表達(dá);3、利用MOG35-55抗原肽免疫C57BL/6小鼠,建立EAE模型,通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)VISTA在EAE小鼠不同病程時(shí)期腦組織及脾臟組織中的表達(dá);4、建立預(yù)防性給藥方案,VISTA胞外段重組蛋白給藥治療EAE小鼠,通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分、病理學(xué)檢測(cè)及Real-time PCR檢測(cè)EAE小鼠發(fā)病高峰期腦組織及脾臟組織中IFN-γ的表達(dá),研究VISTA胞外段重組蛋白對(duì)EAE小鼠的治療作用。研究結(jié)果:1、成功構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET22b-VISTA并獲得VISTA胞外段重組蛋白,純化后的VISTA胞外段重組蛋白對(duì)Con A刺激的脾臟細(xì)胞具有顯著抑制作用;2、構(gòu)建重組質(zhì)粒p PICZa A-VISTA,成功誘導(dǎo)表達(dá)VISTA胞外段重組蛋白;構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體p FUSE-VISTA-m Ig G2a,經(jīng)驗(yàn)證VISTA胞外段重組蛋白成功表達(dá);3、成功建立EAE小鼠模型,發(fā)病率為100%(經(jīng)神經(jīng)功能評(píng)分及病理學(xué)檢測(cè)證明)。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)不同病程時(shí)期VISTA基因在脾臟及腦組織中的表達(dá),結(jié)果顯示VISTA的表達(dá)隨病程變化。4、在預(yù)防性給藥方案下,VISTA胞外段重組蛋白治療EAE小鼠能夠顯著減弱疾病的發(fā)病程度:EAE組小鼠發(fā)病率為100%,給藥組的發(fā)病率為71%;給藥組發(fā)病起始時(shí)間為14.40±0.60天,顯著遲于EAE組(12.14±0.40天,**p0.01);給藥組的平均神經(jīng)功能評(píng)分遠(yuǎn)低于同時(shí)期EAE組小鼠;腦組織和脊髓組織的HE染色結(jié)果顯示,給藥組較EAE組脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著減弱(***P0.001),給藥組小鼠腦組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度比EAE組輕,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脊髓組織LFB染色表明給藥組脫髓鞘現(xiàn)象明顯減輕。且無(wú)論在腦組織或脾臟組織中,VISTA胞外段重組蛋白給藥組IFN-γ基因表達(dá)都顯著低于EAE模型組小鼠。結(jié)論:本研究通過(guò)基因工程手段成功獲得p ET22b-VISTA重組載體,通過(guò)誘導(dǎo)、表達(dá)、純化獲得了具有生物活性的VISTA胞外段重組蛋白;使用MOG35-55免疫小鼠,成功構(gòu)建了EAE小鼠模型,經(jīng)Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VISTA基因在脾臟及腦組織中的表達(dá)隨著EAE小鼠病程變化,證明VISTA參與了EAE病程的發(fā)展;使用VISTA胞外段重組蛋白給藥治療EAE小鼠,能夠延緩EAE小鼠的發(fā)病、降低EAE小鼠的發(fā)病程度并下調(diào)EAE小鼠脾臟和腦組織中IFN-γ的表達(dá)。本研究為探討VISTA對(duì)MS/EAE的治療作用提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：共抑制分子 VISTA 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 IFN-γ
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R744.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 英文縮寫(xiě)一覽表13-15
• 1 引言15-21
• 1.1 共抑制分子的概述15-16
• 1.2 共抑制分子與自身免疫疾病16-17
• 1.3 共抑制分子VISTA17-18
• 1.4 EAE模型研究進(jìn)展18-19
• 1.5 研究目的與意義19-20
• 1.6 技術(shù)路線20-21
• 2 VISTA胞外段重組蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白誘導(dǎo)表達(dá)21-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 2.1.1 主要試劑21-22
• 2.1.2 主要儀器22
• 2.1.3 常用試劑配制22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 2.2.1 原核表達(dá)載體pET22b-VISTA的構(gòu)建23-25
• 2.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株及VISTA胞外段重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)25
• 2.2.3 VISTA胞外段重組蛋白的可溶性分析25
• 2.2.4 VISTA胞外段重組蛋白包涵體變性及純化25-26
• 2.2.5 VISTA胞外段重組蛋白包涵體復(fù)性26
• 2.2.6 VISTA胞外段重組蛋白的Western Blot驗(yàn)證26
• 2.2.7 VISTA胞外段重組蛋白活性驗(yàn)證26-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-32
• 2.3.1 重組質(zhì)粒pET22b-VISTA的構(gòu)建及驗(yàn)證27-29
• 2.3.2 VISTA胞外段重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析29
• 2.3.3 VISTA胞外段重組蛋白包涵體純化29-30
• 2.3.4 VISTA胞外段重組蛋白包涵體復(fù)性及Western Blot驗(yàn)證30-31
• 2.3.5 VISTA胞外段重組蛋白活性驗(yàn)證31-32
• 2.4 討論32-34
• 3 VISTA胞外段重組蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)34-49
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料34-36
• 3.1.1 主要試劑34-35
• 3.1.2 主要儀器35-36
• 3.1.3 常用試劑配制36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法36-41
• 3.2.1 真核表達(dá)載體pFUSE-VISTA-mIgG2a的構(gòu)建36-38
• 3.2.2 RT-PCR檢測(cè)VISTA-IgG2a融合蛋白的mRNA水平38-39
• 3.2.3 VISTA-mIgG2a融合蛋白的表達(dá)及Western Blot鑒定39
• 3.2.4 酵母表達(dá)載體pPICZaA-VISTA的構(gòu)建39
• 3.2.5 重組菌株GS115/pPICZaA-VISTA的構(gòu)建39-40
• 3.2.6 重組菌株GS115/pPICZaA-VISTA的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)40-41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-47
• 3.3.1 重組質(zhì)粒pFUSE-VISTA-mIgG2a的構(gòu)建及驗(yàn)證41-43
• 3.3.2 重組質(zhì)粒pFUSE-VISTA-mIgG2a蛋白表達(dá)驗(yàn)證43-44
• 3.3.3 酵母表達(dá)重組載體pPICZaA-VISTA的構(gòu)建及驗(yàn)證44-46
• 3.3.4 重組菌株GS115/pPICZaA-VISTA的菌液PCR驗(yàn)證46
• 3.3.5 VISTA胞外段重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定46-47
• 3.4 討論47-49
• 4 EAE模型構(gòu)建及VISTA基因在病程中的表達(dá)變化49-62
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料49-50
• 4.1.1 主要試劑耗材49
• 4.1.2 主要儀器49-50
• 4.1.3 常用試劑配制50
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法50-54
• 4.2.1 EAE小鼠模型構(gòu)建50-51
• 4.2.2 EAE小鼠體重監(jiān)測(cè)及神經(jīng)功能評(píng)分51
• 4.2.3 病理組織學(xué)檢測(cè)51-52
• 4.2.4 EAE小鼠脾臟及腦組織總RNA提取52
• 4.2.5 VISTA熒光定量PCR（Real-time PCR）引物的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證52-53
• 4.2.6 EAE小鼠不同病程時(shí)期脾臟、腦組織VISTA mRNA的表達(dá)53
• 4.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析53-54
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-60
• 4.3.1 EAE小鼠的行為及神經(jīng)功能評(píng)分54-55
• 4.3.2 病理組織學(xué)檢測(cè)55-57
• 4.3.3 VISTA Real-time PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增效率驗(yàn)證57-58
• 4.3.4 EAE小鼠不同病程時(shí)期脾臟、腦組織VISTA的表達(dá)58-60
• 4.4 討論60-62
• 5 VISTA胞外段重組蛋白對(duì)EAE小鼠治療作用的研究62-72
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料62
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法62-64
• 5.2.1 EAE小鼠模型給藥62-63
• 5.2.2 EAE小鼠的體重監(jiān)測(cè)及神經(jīng)功能評(píng)分63
• 5.2.3 EAE小鼠的病理組織學(xué)檢測(cè)63
• 5.2.4 Real-time PCR檢測(cè)脾臟、腦組織IFN-γ 的表達(dá)63-64
• 5.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析64
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-70
• 5.3.1 VISTA胞外段重組蛋白對(duì)EAE小鼠病情的影響64-66
• 5.3.2 病理組織學(xué)檢測(cè)66-69
• 5.3.3 脾臟及腦組織中IFN-γ 的表達(dá)69-70
• 5.4 討論70-72
• 6 全文總結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-79
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果79-80
• 致謝80

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1 龔曉亮,朱家鴻;細(xì)菌重組蛋白的表達(dá)及分離純化[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);1991年02期

2 譚智群;;重組蛋白A[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1984年01期

3 姚振宇,呂昌龍,于秉治,曹雅明;CILP-MBP基因重組蛋白的亞克隆構(gòu)建及溫度可溶性誘生表達(dá)[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2002年05期

4 韓彥峰;劉蘭霞;宋麗萍;董霞;張海玲;冷希崗;;組織因子途徑抑制因子重組蛋白表達(dá)和純化方法的優(yōu)化[J];天津醫(yī)藥;2009年01期

5 鄭海洲;劉曉志;宋欣;;重組蛋白在大腸桿菌分泌表達(dá)的研究進(jìn)展[J];天津藥學(xué);2009年04期

6 鄭江花;吳移謀;丁滔;周洲;;肺炎嗜衣原體蛋白酶樣活性因子重組蛋白的表達(dá)與臨床應(yīng)用[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2010年07期

7 賈雪塘;用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)重組蛋白和研制疫苗[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);1997年03期

8 盧一凡,田梜,鄧?yán)^先,肖成祖,馬清鈞;乳腺個(gè)體表達(dá)系統(tǒng)的重組蛋白質(zhì)純化[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;1998年04期

9 ;美國(guó)科學(xué)家利用重組蛋白誘導(dǎo)體細(xì)胞生成干細(xì)胞[J];中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥;2009年10期

10 龍建銀,王會(huì)信;重組蛋白的體外再折疊[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1998年02期

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1 衛(wèi)紅飛;王麗穎;;重組蛋白發(fā)酵[A];東北三省生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要[C];2008年

2 關(guān)怡新;姚善涇;;重組蛋白的體外復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展[A];浙江省化工學(xué)會(huì)成立五十周年慶祝大會(huì)暨第二屆省（市）際化學(xué)化工科技發(fā)展研討會(huì)論文集[C];2001年

3 潘夕春;丁國(guó)富;周紅;;人TLR9受體LRR8片段在大腸桿菌中的重組表達(dá)[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)化療藥理專業(yè)委員會(huì)第九屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2008年

4 任道鋒;;旋毛蟲(chóng)基因Ts43原核表達(dá)及重組蛋白鑒定[A];蘇州市自然科學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)論文匯編(2008-2009)[C];2010年

5 曹珊珊;吳開(kāi)春;張英起;樊代明;;重組蛋白GX1-nrhTNFα的表達(dá)，純化和功能研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下冊(cè)）[C];2007年

6 譚江琳;袁順宗;彭旭;馬兵;黃正根;程文廣;王小娟;甘成軍;賈雄飛;王慶紅;賀偉峰;胡婕;張小容;胡曉紅;羅高興;吳軍;;人重組蛋白P311的原核表達(dá)純化與鑒定[A];第八屆全國(guó)燒傷外科學(xué)年會(huì)論文匯編[C];2007年

7 周曄;蔣天舒;陳燕;婁加陶;吳傳勇;陳波;谷明莉;仲人前;鄧安梅;;結(jié)核桿菌Ag85A重組蛋白的免疫原性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

8 李存保;王美玲;;尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)基因的克隆與原核表達(dá)[A];第三屆泛環(huán)渤海（七省二市）生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)——2012年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2012年

9 王玉梅;孟多佳;時(shí)成波;常軍亮;張寧;遲春萍;曹玉鋒;于愛(ài)東;;抗戊型肝炎病毒重組蛋白P179單克隆抗體的制備及應(yīng)用[A];2011中國(guó)生物制品年會(huì)暨第十一次全國(guó)生物制品學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

10 張靈霞;吳雪瓊;史迎昌;梁建琴;張俊仙;;幾種結(jié)核分支桿菌重組蛋白誘發(fā)豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的研究[A];中國(guó)防癆協(xié)會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議大會(huì)學(xué)術(shù)報(bào)告[C];2001年

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1 劉成剛　左朝勝;復(fù)能與羅氏攜手人類重組蛋白研發(fā)[N];科技日?qǐng)?bào);2006年

2 記者 姜煜;前七月本市民企進(jìn)出口同比增76%[N];北京日?qǐng)?bào);2011年

3 何麗君;哈四個(gè)高技術(shù)項(xiàng)目通過(guò)驗(yàn)收[N];黑龍江經(jīng)濟(jì)報(bào);2009年

4 記者 薛婧;哈爾濱再添新動(dòng)力[N];黑龍江日?qǐng)?bào);2009年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 于長(zhǎng)明;利用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

2 丁大勇;重組再生蛋白3的表達(dá)及抗菌活性的研究[D];吉林大學(xué);2015年

3 孫蕊;雙功能重組蛋白靶向免疫治療腫瘤研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 劉文俊;基于逆向相變和自裂解的重組蛋白表達(dá)和純化系統(tǒng)的建立與應(yīng)用[D];揚(yáng)州大學(xué);2014年

5 王盛典;人白細(xì)胞介素15cDNA克隆和在大腸桿菌中高效表達(dá)及其重組蛋白的純化[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1998年

6 張晶;小鼠白介素1受體拮抗劑重組蛋白的制備及其預(yù)防化療骨髓毒副作用的研究[D];上海交通大學(xué);2008年

7 盧愛(ài)桃;STLV-1/BV重組蛋白ELISA診斷試劑盒的研發(fā)及液相芯片診斷方法的建立[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

8 徐莉娟;診治法布萊氏病的單抗及重組蛋白的研制[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

9 潘紅春;重組蛋白hCH-2的PEG修飾及其初步特性研究[D];重慶大學(xué);2006年

10 楊海;人抗凝血酶Ⅲ的cDNA克隆、表達(dá)、純化及其重組蛋白對(duì)DIC大鼠模型的療效研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2009年

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1 梁振東;重組蛋白A親和介質(zhì)的制備及性能和應(yīng)用研究[D];江南大學(xué);2015年

2 張易;灰葡萄孢蛋白激發(fā)子BcSpl1誘導(dǎo)番茄抗病機(jī)制研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 龔文芝;豬熱激蛋白Gp96N端基因與豬瘟病毒E2基因重組表達(dá)及重組蛋白的免疫原性研究[D];中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2015年

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5 郝明強(qiáng);表達(dá)HPV6型L2△E7E6重組蛋白的工程菌株構(gòu)建及免疫效果評(píng)價(jià)[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2012年

6 齊亞坤;化膿性鏈球菌溶血素O和人視黃醇結(jié)合蛋白的表達(dá)與純化[D];南京師范大學(xué);2015年

7 解帥帥;GlnRS與ArgRS多抗的制備及表達(dá)分析[D];蘇州大學(xué);2016年

8 劉會(huì)珍;擬南芥IAA7和TIR1在E.coli和果蠅S2表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：767454