發(fā)布時間：2017-08-12 12:09

  本文關(guān)鍵詞：CDNF修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療帕金森病的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 大鼠 帕金森病 BMSCs CDNF 基因治療

【摘要】：大腦多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子(CDNF)作為一種新型保守神經(jīng)營養(yǎng)因子,對多巴胺能神經(jīng)元具有特異性的保護(hù)和修復(fù)作用。帕金森病的主要病理變化就是多巴胺能神經(jīng)元的減少。已有研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作為一種多功能干細(xì)胞,移植入帕金森病模型大鼠之后,能在腦內(nèi)遷移、分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,對帕金森病具有一定程度的治療作用。而作為神經(jīng)營養(yǎng)因子的CDNF是否可以改善細(xì)胞移植治療的效果,是值得研究的課題。本實(shí)驗(yàn)在探討PD的發(fā)生發(fā)展與CDNF表達(dá)量變化的基礎(chǔ)上,嘗試以CDNF基因修飾BMSCs,研究轉(zhuǎn)染CDNF基因的BMSCs (CDNF-BMSCs)移植對PD的治療效果。目的：為了探討大腦多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子(CDNF)與帕金森病(PD)發(fā)病之間的關(guān)系,以及以CDNF修飾的BMSCs移植治療PD的效果,對PD模型大鼠腦內(nèi)CDNF的表達(dá)變化及轉(zhuǎn)CDNF基因BMSCs移植治療PD大鼠模型的作用及其機(jī)理進(jìn)行研究。為臨床基因治療帕金森病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：(1)使用大鼠腦立體定位儀,單側(cè)紋狀體內(nèi)單點(diǎn)注射6-羥多巴胺制備帕金森病模型,術(shù)后三周腹腔注射阿撲嗎啡誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)行為,篩選成功模型。免疫組織化學(xué)法、Western blot (WB)及Q-PCR檢測CDNF在帕金森病大鼠模型黑質(zhì)紋狀體中的表達(dá)情況,并以Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測相應(yīng)的TH表達(dá)變化。(2)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒載體,采用Lipo 2000將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1 (+)-CDNF轉(zhuǎn)染至BMSCs,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測BMSCs體外表達(dá)CDNF情況。使用p-巰基乙醇體外誘導(dǎo)CDNF-BMSCs定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,探討基因修飾BMSCs的分化以及分化后表達(dá)CDNF蛋白的潛能。(3)將成功PD模型大鼠分為模型對照組、BMSCs移植組和CDNF-BMSCs移植組三組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),模型對照組、BMSCs移植組和CDNF-BMSCs移植組的大鼠腦紋狀體內(nèi)分別定位注射PBS (10μl)、BMSCs (10μl, 1×104 個/μl細(xì)胞)、CDNF-BMSCs (10μ1,1×104個/μ1細(xì)胞)。分別在治療后2周、5周、8周阿撲嗎啡誘導(dǎo),檢測旋轉(zhuǎn)行為的改變；并于上述時間點(diǎn)分別取大鼠紋狀體,以免疫組織化學(xué)、WB技術(shù)檢測CDNF及相應(yīng)TH的表達(dá)變化,分析比較治療效果及其作用機(jī)理。結(jié)果：(1)對PD模型大鼠腦組織細(xì)胞學(xué)和相關(guān)蛋白表達(dá)的研究,免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型大鼠腦黑質(zhì)區(qū)CDNF、TH陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少；WB實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦的CDNF和TH蛋白表達(dá)量極顯著低于對照組(p0.01,n=10)；Q-PCR分析表明正常組與模型組間CDNF mRNA表達(dá)水平間不存在顯著差異(p0.05,n=5)。本研究顯示PD模型大鼠CDNF mRNA表達(dá)水平與正常大鼠組之間雖無顯著性差異,但多巴胺合成相關(guān)酶及營養(yǎng)因子蛋白表達(dá)卻降低。其原因可能是由于影響CDNF蛋白翻譯或翻譯后修飾的某些因素的水平發(fā)生變化,導(dǎo)致蛋白降低。(2)對重組載體的酶切和測序結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了CDNF重組載體,且轉(zhuǎn)染CDNF基因的BMSCs成功表達(dá)CDNF蛋白；體外實(shí)驗(yàn)中,CDNF基因修飾的BMSCs,經(jīng)β-巰基乙醇誘導(dǎo)可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。說明基因修飾并不影響B(tài)MSCs的分化潛能,且分化后的細(xì)胞仍能表達(dá)CDNF蛋白。(3)細(xì)胞移植治療PD模型大鼠的實(shí)驗(yàn)顯示,移植治療2周后,CDNF-BMSCs組的行為學(xué)改善顯著優(yōu)于BMSCs組(P0.05,n=10)；移植5周后,CDNF-BMSCs組和B MSCs組動物的行為學(xué)改善均極顯著優(yōu)于對照組(P0.01,n=10)。WB結(jié)果顯示：移植治療2周后,(DNF-BMSCs組動物的CDNF蛋白表達(dá)量極顯著高于BMSCs組(P0.01,n=5)；CDNF-BMSCs組TH蛋白表達(dá)量顯著高于BMSCs組(P0.05,n=5)。免疫組織化學(xué)法檢測TH、CDNF陽性的結(jié)果顯示,CDNF-BMSCs組和BMSCs組動物腦紋狀體內(nèi)CDNF、TH陽性細(xì)胞數(shù)均隨時間逐漸增多(n=5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,BMSCs和CDNF-BMSCs移植治療PD模型大鼠后,大鼠的行為學(xué)得到了改善,多巴胺神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能部分恢復(fù),且治療前期使用CDNF-BMSCs的移植治療效果明顯優(yōu)于單獨(dú)移植BMSCs。結(jié)論：本研究運(yùn)用大鼠模型,通過WB、免疫組織化學(xué)、Q-PCR三種檢測方法對帕金森病的發(fā)生發(fā)展與CDNF表達(dá)量的關(guān)系進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)帕金森病的發(fā)病與紋狀體CDNF蛋白表達(dá)量的降低有關(guān)。本研究構(gòu)建了CDNF真核表達(dá)質(zhì)粒載體、成功修飾了BMSCs,在體外可以表達(dá)CDNF蛋白；CDNF-BMSCs腦內(nèi)移植治療后,在一定時間內(nèi)能顯著提高BMSCs移植治療PD模型大鼠的效果。研究結(jié)果提示,CDNF可以作為基因治療PD的候選基因,該實(shí)驗(yàn)為基因治療帕金森病提供了實(shí)用的技術(shù)途徑。
【關(guān)鍵詞】：大鼠 帕金森病 BMSCs CDNF 基因治療
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 符號說明9-10
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述10-22
• 1 帕金森病發(fā)病機(jī)制10-11
• 2 PD治療方法的概述11-12
• 3 基因治療PD的研究現(xiàn)況12-17
• 參考文獻(xiàn)17-22
• 第二部分 研究論文22-63
• 第一章 帕金森病模型大鼠腦內(nèi)CDNF的水平的研究22-37
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2 實(shí)驗(yàn)方法24-28
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-32
• 4 討論32-34
• 參考文獻(xiàn)34-37
• 第二章 CDNF表達(dá)載體的構(gòu)建及體外表達(dá)37-53
• 1 實(shí)驗(yàn)材料37-39
• 2 實(shí)驗(yàn)方法39-44
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-48
• 4 討論48-50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 第三章 CDNF基因修飾的BMSCs移植治療PD大鼠的研究53-63
• 1 實(shí)驗(yàn)材料53-55
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法55-57
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-60
• 4 討論60-62
• 參考文獻(xiàn)62-63
• 全文小結(jié)63-64
• 致謝64
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的主要論文64-65

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本文編號：661502