本文關(guān)鍵詞：TFPI-2參與SH-SY5Y細(xì)胞化學(xué)缺氧調(diào)控機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:缺氧損傷見于多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如腦梗死、腦出血、腦腫瘤、高原腦水腫等等。研究發(fā)現(xiàn),缺氧可以引起腦部一系列功能蛋白和基因表達(dá)的變化,如腦紅蛋白等等。其中缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)是目前已知的介導(dǎo)缺氧過程最重要的核轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)控上百種基因的表達(dá)。HIF調(diào)控的缺氧通路廣泛參與能量代謝、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、血管生成、細(xì)胞凋亡和腫瘤侵襲等病理過程,是缺氧過程中重要的調(diào)控因子。到目前為止,腦缺氧損傷的機(jī)制和調(diào)控通路并不完善,探索腦缺氧損傷新的調(diào)控因子,進(jìn)一步完善缺氧通路,可以為我們提供神經(jīng)保護(hù)的新靶點(diǎn),對于腦部缺氧性疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。為尋求新的缺氧相關(guān)標(biāo)志性因子,本課題組利用基因芯片及mi RNA芯片等技術(shù)對低壓缺氧大鼠腦皮質(zhì)進(jìn)行差異因子的檢測,發(fā)現(xiàn)了TFPI-2和mi R-92a-2這兩個(gè)具有靶向關(guān)系的差異表達(dá)因子,其中TFPI-2表達(dá)與缺氧呈正相關(guān),mi R-92a-2則相反。組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)是一種天然的抗凝因子,是內(nèi)源性TF抑制物,屬Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制家族。TFPI-2是一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑,可以抑制包括纖溶酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等在內(nèi)多種蛋白酶的活性,維持細(xì)胞外基質(zhì)的完整性。研究發(fā)現(xiàn),TFPI-2參與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲過程,與腫瘤組織血管生成、細(xì)胞凋亡等過程密切相關(guān)。但是TFPI-2在缺氧過程中的變化及調(diào)控機(jī)制沒有得到充分研究,TFPI-2是否通過HIF經(jīng)典途徑參與細(xì)胞缺氧損傷也并不清楚。氯化鈷是常用的細(xì)胞化學(xué)缺氧誘導(dǎo)劑,可抑制HIF-1α降解,激活HIF缺氧通路,模擬細(xì)胞缺氧環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞氯化鈷化學(xué)缺氧細(xì)胞損傷模型,探究TFPI-2在SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞缺氧損傷中的變化及可能的調(diào)控機(jī)制。方法:1 CoCl_2缺氧對SH-SY5Y細(xì)胞活性和形態(tài)的影響1.1培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,加入不同濃度CoCl_2(0、100、200、400μmol/L)處理細(xì)胞,分別在6小時(shí)和24小時(shí)通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài),對細(xì)胞進(jìn)行HE染色,觀察細(xì)胞化學(xué)缺氧前后形態(tài)變化。1.2使用不同濃度CoCl_2(0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500μmol/L)處理SH-SY5Y細(xì)胞,利用MTT法檢測細(xì)胞活性變化。1.3用100μmol/L CoCl_2處理SH-SY5Y細(xì)胞,MTT法檢測缺氧不同時(shí)間(0、6、12、24、48、72小時(shí))細(xì)胞活性變化。2 CoCl_2缺氧前后SH-SY5Y細(xì)胞TFPI-2、mi R-92a表達(dá)水平檢測2.1利用Western blot技術(shù),檢測100μmol/L CoCl_2缺氧不同時(shí)間(1、2、4、6、8小時(shí))SH-SY5Y細(xì)胞HIF-1α和TFPI-2、VEGF表達(dá)水平,對氯化鈷化學(xué)缺氧后基因表達(dá)變化趨勢進(jìn)行分析。2.2 Real-time PCR法檢測100μmol/L CoCl_2缺氧8h后HIF-1αm RNA、TFPI-2 m RNA和VEGF m RNA表達(dá)變化。2.3 Real-time PCR法檢測100μmol/L CoCl_2缺氧8h后mi R-92a表達(dá)變化。3 YC-1預(yù)處理對SH-SY5Y細(xì)胞缺氧后TFPI-2表達(dá)的影響3.1用10μmol/L、100μmol/L YC-1預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí),對照組加入相同濃度的DMSO培養(yǎng)2小時(shí),然后加入100μmol/L CoCl_2共培養(yǎng)細(xì)胞8h,Ed U法檢測各組細(xì)胞增殖活性變化。3.2 Western blot檢測缺氧后YC-1預(yù)處理對缺氧后細(xì)胞TFPI-2、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1 CoCl_2缺氧對細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響并降低細(xì)胞存活率CoCl_2缺氧后SH-SY5Y細(xì)胞胞體變小,突觸變細(xì)變短,核仁膨脹,隨著氯化鈷濃度缺氧時(shí)間延長,細(xì)胞逐漸出現(xiàn)皺縮凋亡。通過MTT檢測發(fā)現(xiàn),CoCl_2缺氧處理會(huì)顯著降低細(xì)胞活性(P0.05),細(xì)胞存活率下降呈劑量和時(shí)間依賴性。2 CoCl_2缺氧可以降低細(xì)胞內(nèi)mi R-92a含量,上調(diào)TFPI-2 m RNA和蛋白表達(dá)水平Western blot結(jié)果顯示,CoCl_2缺氧處理后2小時(shí)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平開始升高,在6-8小時(shí)趨于穩(wěn)定。CoCl_2處理可以有效激活HIF缺氧通路,建立細(xì)胞缺氧模型。缺氧4小時(shí)后TFPI-2蛋白表達(dá)水平開始升高(P0.05),隨著缺氧時(shí)間延長,細(xì)胞內(nèi)TFPI-2表達(dá)水平逐漸升高而后穩(wěn)定表達(dá),與HIF-1α變化趨勢相似。Real-time PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,缺氧組細(xì)胞TFPI-2、VEGF m RNA表達(dá)顯著上升,而缺氧組細(xì)胞mi R-92a表達(dá)水平較對照組明顯降低(P0.05)。3 YC-1預(yù)處理可減弱CoCl_2缺氧對細(xì)胞增殖活性的抑制,降低缺氧后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)TFPI-2表達(dá)水平。Ed U檢測顯示,缺氧后,SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性降低,而YC-1預(yù)處理可減弱缺氧對細(xì)胞增殖的抑制作用(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,與缺氧組相比,YC-1預(yù)處理可以抑制缺氧后細(xì)胞HIF-1α水平,在YC-1預(yù)處理組VEGF、TFPI-2蛋白表達(dá)水平較缺氧組降低,呈劑量依賴性(P0.05)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功建立SH-SY5Y細(xì)胞氯化鈷化學(xué)缺氧模型,證實(shí)TFPI-2m RNA及蛋白水平在SH-SY5Y細(xì)胞化學(xué)缺氧后顯著升高,其表達(dá)變化可能受HIF-1—VEGF缺氧途徑調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：組織因子途徑抑制物-2 SH-SY5Y細(xì)胞 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 缺氧 血管內(nèi)皮生長因子 氯化鈷
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-26
• 結(jié)果26-28
• 附圖28-35
• 附表35-38
• 討論38-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 綜述 microRNA與腦缺氧損傷45-56
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 致謝56-57
• 個(gè)人簡歷57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 高宏生;黃菲;王毅錚;李國良;陳虹;李靈芝;張永亮;;低壓缺氧對大鼠腦皮質(zhì)基因表達(dá)譜及其TAC1和MT1A變化的影響[J];中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2013年08期

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本文編號：654916