本文關(guān)鍵詞：酸敏感鉀離子通道TASK3在高鉀神經(jīng)元損傷中的作用及其一過(guò)性表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建

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【摘要】：急性缺氧缺血早期,神經(jīng)細(xì)胞的膜通道功能和膜電位發(fā)生改變,胞內(nèi)鈉離子和鈣離子濃度顯著升高,胞外鉀離子顯著增加,引起細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。酸敏感鉀離子通道-3(TWIK-related acid-sensitive K+channel-3,TASK3)是雙孔鉀離子通道家族中較為特殊的一員,參與神經(jīng)元凋亡調(diào)控過(guò)程。TASK3通道功能狀態(tài)決定了細(xì)胞靜息電位,并且控制神經(jīng)元放電頻率。在神經(jīng)元缺氧損傷中,TASK3通過(guò)何種途徑發(fā)揮其生理學(xué)功能鮮有報(bào)道。本研究旨在探究TASK3通道在高鉀神經(jīng)元損傷過(guò)程中作用,探討在高鉀損傷情況下TASK3通道活性對(duì)細(xì)胞凋亡的關(guān)系。此外,通過(guò)利用原核表達(dá)體系構(gòu)建融合蛋白TASK3-Tat,借助Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的穿透細(xì)胞膜的能力,構(gòu)建TASK3蛋白一過(guò)性表達(dá)體系,為進(jìn)一步研究TASK3在神經(jīng)元高鉀損傷或缺血損傷過(guò)程中發(fā)揮功能提供新的技術(shù)手段和科研思路。第一部分TASK3在高鉀神經(jīng)元損傷過(guò)程中的保護(hù)作用目的通過(guò)胞外高濃度鉀溶液處理神經(jīng)元細(xì)胞模擬機(jī)體缺血損傷,探究TASK3通道蛋白對(duì)高鉀損傷神經(jīng)細(xì)胞的作用。方法不同濃度鉀溶液孵育SH-SY5Y細(xì)胞6h,倒置顯微鏡下觀察不同處理組細(xì)胞形態(tài)變化,并CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力變化;采用CCK-8法分析不同濃度的TASK3激動(dòng)劑氟烷和抑制劑精胺對(duì)高鉀損傷后神經(jīng)元細(xì)胞增殖的變化;通過(guò)Real-Time PCR和免疫印記手段檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 m RNA豐度及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果給予細(xì)胞外不同濃度鉀溶液處理后,發(fā)現(xiàn)胞外鉀離子對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響存在劑量性依賴和時(shí)間性依賴;添加不同濃度TASK3抑制劑精胺(50μM、100μM、500μM、1000μM)可顯著降低SH-SY5Y細(xì)胞活力;而添加不同濃度TASK3激動(dòng)劑氟烷(0.4m M、0.8m M、1.6m M、8m M)可顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力;在高鉀損傷細(xì)胞模型中,精胺抑制TASK3通道活性后,Bax表達(dá)有所上調(diào),Bcl-2/Bax比值明顯降低,顯示神經(jīng)元細(xì)胞損傷加劇。而異氟烷增強(qiáng)該通道活性,下調(diào)Bax表達(dá),Bcl-2/Bax比值明顯升高,減緩神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。結(jié)論TASK3通道在高鉀神經(jīng)元損傷過(guò)程中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用。第二部分TASK3-Tat重組蛋白的構(gòu)建及表達(dá)目的構(gòu)建外源重組蛋白TASK3,借助轉(zhuǎn)導(dǎo)肽Tat作用,透過(guò)細(xì)胞膜,發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。方法重組質(zhì)粒p TASK3-GFP-Tat構(gòu)建;利用Western Blot檢測(cè)TASK3表達(dá);利用Ni2+親和層析柱和SDS-PAGE檢測(cè)TASK3蛋白表達(dá);熒光顯微鏡檢測(cè)TASK3的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用及細(xì)胞定位。結(jié)果重組質(zhì)粒p TASK3-GFP-Tat構(gòu)建正確。純化后的重組蛋白TASK3-GFP-Tat成功透過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y。結(jié)論重組蛋白TASK3在Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽介導(dǎo)作用下,透過(guò)細(xì)胞膜,成功建立了一過(guò)性表達(dá)重組蛋白TASK3的SH-SY5Y細(xì)胞株,為研究TASK3功能提供新的研究方法。
【關(guān)鍵詞】：高鉀損傷 TASK3 神經(jīng)保護(hù) 缺氧缺血損傷 凋亡蛋白 轉(zhuǎn)導(dǎo)肽 HIV-1反式激活因子 酸敏感鉀離子通道-3 原核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 第一部分 TASK3在高鉀神經(jīng)元損傷過(guò)程中的保護(hù)作用10-31
• 前言10-11
• 1 材料與方法11-21
• 2 結(jié)果21-26
• 3 討論26-28
• 4 小結(jié)28-29
• 參考文獻(xiàn)29-31
• 第二部分 TASK3-TAT重組蛋白的一過(guò)性表達(dá)構(gòu)建31-51
• 前言31-32
• 1 材料與方法32-41
• 2 結(jié)果41-44
• 3 討論44-47
• 4 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 綜述：TASK3通道及其功能研究現(xiàn)狀51-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 縮略語(yǔ)表63-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況64-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66

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本文編號(hào)：648592