發(fā)布時(shí)間：2017-07-31 05:25

  本文關(guān)鍵詞：硫化氫對PC12細(xì)胞自噬和α-synuclein降解的調(diào)控作用及分子機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 硫化氫 自噬 α-synuclein 帕金森病 硫巰基化修飾

【摘要】：目的:研究氣體信號分子硫化氫對PC12細(xì)胞自噬和α-synuclein的降解調(diào)控作用,并探討相關(guān)分子機(jī)制。方法:以高分化PC12細(xì)胞為工具細(xì)胞;用環(huán)境毒素魚藤酮建立帕金森病細(xì)胞模型;分別以硫氫化鈉(Sodium hydrosulfide,Na HS)和GYY4137為硫化氫的速釋和緩釋供體。用MTT法檢測細(xì)胞活力;Western blot方法檢測自噬底物蛋白SQSTM1/p62(sequestosome-1)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3)、非m TOR依賴通路蛋白Beclin1、m TOR依賴通路及上游激酶AMPK、m TOR和p70S6K及其磷酸化水平、以及α-synuclein的蛋白表達(dá)變化;使用NP40法進(jìn)一步分離可溶和不可溶性α-synuclein;運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse-transcription PCR,rt-PCR)方法檢測α-synuclein的轉(zhuǎn)錄水平;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒,熒光顯微鏡觀察硫化氫處理后LC3點(diǎn)狀熒光表達(dá)分布的變化;Biotin Switch Technique(BST)檢測AMPK的硫巰基化(S-sulfhydration)變化。結(jié)果:(1)以50、100和200μM Na HS作用于PC12細(xì)胞24h,LC3II蛋白水平升高,而p62蛋白表達(dá)下降,其中100μM Na HS作用最為顯著,與空白對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;以25、50和100μM GYY4137作用后,LC3II和p62蛋白表達(dá)出現(xiàn)類似變化,GYY4137在50μM時(shí)作用最為顯著,與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而且,100μM Na HS和50μM GYY4137作用24h,均使得轉(zhuǎn)染了GFP-LC3的PC12細(xì)胞LC3II點(diǎn)狀聚集數(shù)目增加。上述劑量范圍的Na HS和GYY4137作用24h,對細(xì)胞活力無明顯影響。(2)Na HS和GYY4137作用后,Beclin 1蛋白水平并無明顯改變;然而,100μM Na HS能夠抑制m TOR及其下游底物p70S6K的磷酸化,而升高其上游激酶AMPK的磷酸化水平,50μM GYY4137亦有此作用;此外,Na HS能夠顯著升高AMPK的S-sulfhydration修飾水平。(3)100 n M魚藤酮單獨(dú)作用PC12細(xì)胞24h后,α-synuclein蛋白水平明顯升高,其中NP40不可溶部分α-synuclein約增加3倍,Na HS預(yù)處理能顯著減少魚藤酮誘導(dǎo)的α-synuclein的蓄積,而RT-PCR結(jié)果顯示魚藤酮和Na HS單獨(dú)作用對α-synuclein的m RNA水平均無顯著影響。(4)Na HS預(yù)處理能顯著減少魚藤酮所引起的p62升高和LC3下降,提示硫化氫可能通過上調(diào)自噬水平、促進(jìn)α-synuclein的自噬性降解而減少其在細(xì)胞內(nèi)的蓄積。結(jié)論:在一定的劑量范圍內(nèi),硫化氫通過S-sulfhydration修飾促進(jìn)AMPK磷酸化增加、抑制m TOR/p70S6K活性而上調(diào)PC12細(xì)胞內(nèi)的自噬活性,減少α-synuclein在胞內(nèi)的蓄積。
【關(guān)鍵詞】：硫化氫 自噬 α-synuclein 帕金森病 硫巰基化修飾
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-15
• 參考文獻(xiàn)12-15
• 材料和方法15-28
• 1 實(shí)驗(yàn)材料15-18
• 1.1 主要試劑15-16
• 1.2 主要儀器16
• 1.3 溶液配制16-18
• 2 實(shí)驗(yàn)方法18-28
• 2.1 細(xì)胞株18
• 2.2 細(xì)胞復(fù)蘇18-19
• 2.3 細(xì)胞的傳代19
• 2.4 MTT檢測細(xì)胞活力19
• 2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)19-21
• 2.6 RT-PCR技術(shù)檢測mRNA的表達(dá)21-23
• 2.7 質(zhì)粒的擴(kuò)增23
• 2.8 質(zhì)粒DNA小量提取23-24
• 2.9 轉(zhuǎn)染GFP-LC324-25
• 2.10 NP-40 法分離可溶和不可溶 α-synuclein25-26
• 2.11 Biotin Switch Technique(BST)檢測S-巰基化水平26-27
• 2.12 統(tǒng)計(jì)方法27-28
• 結(jié)果28-37
• 1 NaHS和GYY4137 對PC12 細(xì)胞活力的影響28
• 2 H_2S誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞自噬活性上調(diào)28-30
• 3 H_2S抑制MTOR/P70S6K信號通路活性30-32
• 4 H_2S促使AMPK磷酸化升高32-33
• 5 H_2S促使AMPK硫巰基化修飾增加33-34
• 6 H_2S能逆轉(zhuǎn)魚藤酮誘導(dǎo)的自噬障礙及 α-synuclein的聚集34-37
• 討論37-41
• 參考文獻(xiàn)41-44
• 結(jié)論44-45
• 綜述 氣體信號分子NO、CO和H_2S的生物學(xué)研究進(jìn)展45-55
• 摘要45-46
• 1 NO46-48
• 1.1 NO的合成代謝46
• 1.2 NO的生物學(xué)功能46-47
• 1.3 NO的分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制47-48
• 2 CO48-49
• 2.1 CO合成代謝48
• 2.2 CO的生物學(xué)功能48-49
• 2.3 CO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制49
• 3 H_2S49-52
• 3.1 H_2S的合成代謝49-50
• 3.2 H_2S的生物學(xué)功能50-51
• 3.3 H_2S的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制51-52
• 4 結(jié)語與展望52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文及科研成果55-56
• 中英文對照縮略詞表56-57
• 致謝57-58

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