本文關(guān)鍵詞：自噬對Hemin所致神經(jīng)元損傷的作用及其相關(guān)機制研究

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【摘要】：目的:腦出血后自噬激活對神經(jīng)元損傷的影響尚不明晰,可能在某種特定條件下表現(xiàn)出促生存或促死亡的不同作用。本研究旨在以氯高鐵血紅素Hemin誘導的神經(jīng)元細胞損傷作為腦出血體外模型,通過直接調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞自噬水平,探究自噬對于的作用極其相關(guān)機制,并進一步探究腦出血條件下自噬與凋亡間的相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。方法:運用原代細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)原代神經(jīng)元細胞,以適量濃度的Hemin誘導神經(jīng)元損傷作為腦出血的體外模型,利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)(10mM)及mTOR抑制劑雷帕霉素(Rapamycin,RAP)(100nM)干預腦出血后神經(jīng)元的自噬水平,使用熒光染料碘化丙啶(Propidium iodide,PI)標記死亡細胞并計算細胞死亡率,應用CCK-8試驗檢測細胞生存率,應用Western Blot(WB)半定量檢測自噬相關(guān)蛋白:LC3,p62/SQSTM1(p62)及Beclin1的表達水平;以及凋亡相關(guān)蛋白:cleaved-Caspase3的表達水平。免疫熒光檢測自噬、凋亡相關(guān)蛋白在神經(jīng)元細胞原位表達的水平。結(jié)果:(1)經(jīng)改進的小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)出的細胞生長狀況良好,純度高,過程簡便,是神經(jīng)科學研究中建立體外模型的好載體;神經(jīng)元原代細胞培養(yǎng)成功后,經(jīng)CCK-8實驗評估細胞生存率和PI/MAP2評估神經(jīng)元死亡率,確定Hemin劑量50μmol/L,給藥6小時,可作為本研究中建立腦出血體外模型的給藥方案。(2)PI染色結(jié)果顯示:Hemin作用后神經(jīng)元死亡數(shù)量增加,自噬抑制劑3-MA能夠顯著減少(p0.05)神經(jīng)元死亡而自噬激動劑RAP能夠顯著增加(p0.01)神經(jīng)元死亡率。(3)WB及免疫熒光結(jié)果顯示:經(jīng)自噬抑制劑3-MA預處理的神經(jīng)元細胞自噬相關(guān)蛋白的表達水平顯著降低(p0.05)而凋亡相關(guān)蛋白表達顯著增加(p0.05);于此相對應的,經(jīng)自噬激動劑RAP預處理的神經(jīng)元細胞的自噬相關(guān)蛋白的表達水平顯著增加(p0.05)而凋亡相關(guān)蛋白表達顯著降低(p0.05)。結(jié)論:(1)經(jīng)改進的小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)出的細胞生長狀況良好,純度高,過程簡便,是神經(jīng)科學研究中建立體外模型的好載體;(2)PI/MAP2評估神經(jīng)元死亡率可消除原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)中非神經(jīng)元細胞的干擾,Hemin劑量50μmol/L作用6小時,可作為建立小鼠腦出血體外模型的最佳策略;(3)促進自噬可增加Hemin所致神經(jīng)元損傷,抑制自噬能夠減少Hemin所致神經(jīng)元損傷;(4)自噬對Hemin所致神經(jīng)元損傷的保護作用與調(diào)節(jié)細胞凋亡通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：自噬 凋亡 神經(jīng)元細胞 腦出血
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743.34
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-11
• 第一部分 小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞原代培養(yǎng)及體外腦出血模型的建立11-19
• 第一節(jié) 小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)11-14
• 第二節(jié)體外腦出血模型的建立14-18
• 小結(jié)18-19
• 第二部分 自噬對Hemin誘導的神經(jīng)元凋亡的影響19-39
• 第一節(jié) 自噬對于Hemin誘導的神經(jīng)元損傷后的PI陽性細胞數(shù)量的影響19-22
• 第二節(jié) 3-MA對Hemin誘導的神經(jīng)元損傷后自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響22-34
• 第三節(jié) 雷帕霉素對于Hemin誘導的神經(jīng)元損傷后自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響34-38
• 小結(jié)38-39
• 討論39-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-48
• 不足與展望48-49
• 綜述49-57
• 參考文獻54-57
• 中英文對照縮略詞表57-58
• 攻讀碩士期間公開發(fā)表的論文58-59
• 致謝59-60

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本文編號：567402