本文關(guān)鍵詞：靶向RWDD3基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及功能鑒定

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【摘要】：目的構(gòu)建RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子(RWDD3)shRNA慢病毒表達(dá)載體,為探討RNA干擾技術(shù)抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞RWDD3基因的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。方法設(shè)計(jì)RWDD3的3條siRNA的靶點(diǎn)序列,合成含干擾序列的雙鏈DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)shRNA,分別與雙酶切后的載體連接,構(gòu)建3種重組質(zhì)粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取陽性克隆質(zhì)粒測序,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,生產(chǎn)慢病毒顆粒,并檢測病毒滴度。將3種重組慢病毒及陰性對照病毒分別感染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251,實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。結(jié)果測序結(jié)果證實(shí)3種慢病毒載體均包裝成功,滴度分別為5×10~(11) TU/L、4×10~(11) TU/L、5×10~(11) TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表達(dá)量均較陰性對照組和未感染組明顯降低(P0.05);其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用顯著,mRNA表達(dá)下調(diào)79.2%,蛋白表達(dá)下調(diào)68.2%(P0.05);而陰性感染對照組和未感染組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建3種RWDD3shRNA慢病毒表達(dá),可有效下調(diào)U251細(xì)胞RWDD3mRNA和蛋白的表達(dá),其為進(jìn)一步研究以RWDD3為靶點(diǎn)的腦膠質(zhì)瘤基因治療提供穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體奠定基礎(chǔ)。
【作者單位】： 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;
【關(guān)鍵詞】： 腦膠質(zhì)瘤 RWDD 慢病毒 shRNA
【基金】：江西省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目(No.20132BAB205043) 江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.GJJ14066)~~
【分類號】：R739.41;R3416
【正文快照】： 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,系統(tǒng)Lentivector　Packaging　Kit購自上海吉凱基因具有無控性增殖、侵襲性生長、易復(fù)發(fā)、預(yù)后極差的特化學(xué)公司;限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ和連接試劑點(diǎn)[1-2]。其本質(zhì)上是一種多基因異常疾病,由于原癌盒購自NEB公司;質(zhì)粒提取試劑盒

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本文編號：559792