本文關鍵詞：N-乙酰半胱氨酸可恢復TDP-25所致的運動神經元樣細胞持續(xù)性鈉通道功能異常

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【摘要】：肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種選擇性損害上、下運動神經元的神經變性疾病。本病具有慢性、進行性、致死性的特點。本病的大部分患者是散發(fā)型,約10%患者存在家族性常染色體顯性遺傳史,即為家族型,20%的家族型患者存在銅/鋅超氧化物岐化酶(SOD1)基因突變。目前研究發(fā)現(xiàn),約3%的家族型患者以及2.9%散發(fā)型患者存在TAR-DNA結合蛋白43(TDP-43)基因突變,表明ALS的發(fā)病與TDP-43基因突變有著密切的關系。TDP-43蛋白是一種由定位于chrlp36.2的TARDBP基因編碼的核蛋白,具有結合單鏈DNA、RNA的功能,同時參與m RNA的轉錄并維持其結構穩(wěn)定性。許多研究表明,在FTLD-TDP或者ALS患者發(fā)現(xiàn)的TDP-43蛋白通常表現(xiàn)為高度磷酸化、泛素化、易裂解、移位到細胞質并聚集。這些特征使TDP-43喪失了正常功能,相反具有毒性作用,誘導細胞凋亡以及運動神經元軸突變短,髓鞘的脫失。目前發(fā)現(xiàn)突變的TDP-43會引起線粒體功能障礙、氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)TDP-25蛋白的分子量為25k Da,是TDP-43的C末端被酶分解的片段之一。TDP-25可以促進TDP-43包涵體的形成,對運動神經元具有更強的毒性作用。TDP-25引起線粒體功能紊亂以及加速氧化損傷,運動神經元變性,在ALS的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。TDP-43可引起細胞的高興奮性,興奮性增高的神經元會導致異常動作電位的爆發(fā),引起細胞內鈣超載,產生興奮性毒性。目前研究發(fā)現(xiàn)TDP-43的表達會引起細胞線粒體功能障礙,能量不足,加重氧化損傷。主要表現(xiàn)為活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)增多,細胞不能維持正常的清除作用。大量的活性氧聚集使得線粒體膜電位異常以及呼吸鏈損傷,引起能量依賴性離子通道功能改變,同時使得細胞內高鉀和細胞外高鈉的離子濃度發(fā)生改變。目前研究還發(fā)現(xiàn)ALS患者運動神經元鈉離子內向電流的增加,其機制主要與持續(xù)性鈉通道的表達上調和(或)該通道功能異常相關,而內向鈉離子電流增大直接導致了運動神經元較易爆發(fā)動作電位從而增加了能量的消耗和自由基的產生。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是一種分子量較小的半胱氨酸的衍生物。由于其小的分子量以及分子結構決定了易通過細胞膜,進入細胞后脫乙�；蔀楣入赘孰牡暮铣傻谋仨毎被�,又稱為還原型谷胱甘肽的前體。NAC的主要功能一方面是維持細胞內氧化還原電勢穩(wěn)定,另一方面還可以透過細胞膜及線粒體膜通過分子內結構清除細胞內的ROS,成為一種有效的抗氧化劑。本實驗通過應用不同濃度NAC作用于穩(wěn)定轉染TDP-25運動神經元細胞后記錄持續(xù)性鈉電流,進一步分析NAC對穩(wěn)定轉染TDP-25細胞的作用以及TDP-25在ALS發(fā)病機制中的作用。目的:本實驗研究目的是分別檢測穩(wěn)定轉染TDP-25和空質粒的運動神經元樣細胞的持續(xù)性鈉電流,并比較電流是否存在差別;分析不同濃度N-乙酰半胱氨酸對穩(wěn)定轉染TDP-25運動神經元樣細胞的作用。進一步探究穩(wěn)定轉染TDP-25運動神經元樣細胞的興奮性增高與氧化損傷在ALS發(fā)病機制中的作用。方法:本實驗應用穩(wěn)定轉染TDP-25和Empty(空質粒)兩種細胞,該NSC34細胞系由本實驗室構建,應用規(guī)范的細胞培養(yǎng)方法對其進行培養(yǎng),首先通過篩選單克隆細胞,然后免疫組化鑒定TDP-25蛋白的表達程度,選擇TDP-25蛋白表達95%以上的細胞。將這些篩選后的單克隆細胞系進行培養(yǎng)、傳代,獲得穩(wěn)定轉染TDP-25細胞以及空質粒細胞。在全細胞膜片鉗技術下,記錄穩(wěn)定轉染TDP-25細胞、空質粒細胞的持續(xù)性鈉電流;將終濃度分別為20umol/LNAC、50umol/LNAC、80umol/LNAC作用于TDP-25細胞24小時后,分別記錄3組不同濃度下細胞的持續(xù)性鈉電流的水平。統(tǒng)計持續(xù)性鈉電流的差異性。結果:TDP-25組與Empty組的持續(xù)性鈉電流相比,TDP-25組的電流幅度以及電流密度增大(P=0.03,P0.05具有統(tǒng)計學意義)。給予藥物濃度分別為20umol/L,50 umol/L,80 umol/L的NAC作用于TDP-25組細胞24小時后的持續(xù)性鈉電流相比較,50umol/LNAC組的持續(xù)性鈉電流幅度減少明顯(P=0.04,P0.05具有統(tǒng)計學意義);20umol/L組電流幅度減小,與TDP-25組比較變化不明顯(P0.05無統(tǒng)計學意義);80 umol/L濃度時發(fā)現(xiàn)無明顯變化(P0.05無統(tǒng)計學意義)。五組間I-V曲線進行比較分析得出持續(xù)性鈉電流均存在電壓依賴性,曲線呈現(xiàn)一個V字形,Empty組、50μmol/L NAC組I-V曲線較TDP-25組上移。統(tǒng)計結果如下:TDP-25組:n=25電流幅度:-74.69±17.64p A;電流密度:-3.18±1.723 p A/pf Empty組:n=20電流密度:-30.60±6.72p A;電流密度:0.52±0.024p A/pf藥物作用TDP-25結果如下:20μmol/L NAC組:n=10電流幅度:-62.62±11.63p A;電流密度:0.52±0.024p A/pf50μmol/L NAC組::n=10電流幅度:-34.56±10.07p A;電流密度:-1.73±0.42 p A/pf80μmol/L NAC組:n=10電流幅度:-66.30±18.23p A;電流密度:-3.06±0.955 p A/pf結論:在本實驗中,我們得出穩(wěn)定表達TDP-25的運動神經元樣細胞與對照組比較持續(xù)性鈉電流明顯增大,提示細胞興奮性水平增高,在ALS的發(fā)病機制中起到關鍵作用。N-乙酰半胱氨酸具有抑制氧化應激減少氧化產物作用,50μmol/L NAC降低持續(xù)性鈉電流幅度,應用20μmol/L和80μmol/L的NAC不能恢復TDP-25誘導的持續(xù)性鈉通道功能,提示過少或過多氧自由基的清除,均不能對TDP-25所致的運動神經元變性起到保護作用。
【關鍵詞】：肌萎縮側索硬化 持續(xù)性鈉通道 TDP-25 氧化應激 N-乙酰半胱氨酸 全細胞膜片鉗技術
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R744.8
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-19
• 結果19-23
• 附圖23-29
• 討論29-31
• 結論31-32
• 參考文獻32-37
• 綜述 持續(xù)性鈉電流的相關研究37-50
• 參考文獻44-50
• 致謝50-51
• 個人簡歷51

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