本文關(guān)鍵詞：癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中海馬神經(jīng)元損傷及其可能機(jī)制的研究

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【摘要】：研究背景氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)可以引起幾個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元的嚴(yán)重病變,其中以海馬區(qū)損傷最為顯著。許多研究認(rèn)為海馬神經(jīng)元損傷可能與谷氨酸α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸(AMPA)受體介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性有關(guān)。但成年大鼠海馬AMPA受體(AMPAR)主要由第二亞單位(GluR2)組成,對(duì)鈣離子的滲透性較低,難以造成鈣離子內(nèi)流引起鈣超載而致神經(jīng)元損傷。AMPAR激活是怎樣引起神經(jīng)元損傷的機(jī)制尚不清楚。近有研究發(fā)現(xiàn)GluR2與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)形成的蛋白復(fù)合物在腦缺血模型中上調(diào),引起神經(jīng)元變性。而使用破壞該復(fù)合物耦合作用的干擾肽可以明顯減少模型中的神經(jīng)元病變,保護(hù)神經(jīng)元損傷。研究目的GluR2/GAPDH在SE中的耦合變化現(xiàn)象尚未見報(bào)道,因此,本研究通過建立氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的SE模型,研究海馬神經(jīng)元的損傷、GluR2蛋白表達(dá)變化以及GluR2/GAPDH蛋白復(fù)合物的耦合變化,探討SE中海馬神經(jīng)元損傷可能存在的機(jī)制,從而為指導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)患者的臨床治療提供新靶點(diǎn),進(jìn)而減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)患者的社會(huì)、心理負(fù)擔(dān),甚至為治愈疾病提供新線索。研究方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及研究方案：健康雄性6-8周Wistar大鼠82只,體重200-240 g,飼養(yǎng)溫度23-25℃,自由進(jìn)水與飲食。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為2組：正常對(duì)照組(n=20),SE組(n=62)。SE組又隨機(jī)分為SE后1h、6 h、24 h、72 h、7 d組。隨機(jī)選擇正常對(duì)照及SE后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠各6只,制備海馬石蠟切片后進(jìn)行Nissl及原位末端標(biāo)記(TUNEL)染色；隨機(jī)選擇正常對(duì)照及SE后1 h、6h、24 h、72 h、7d大鼠各6只,提取海馬組織蛋白后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。根據(jù)海馬神經(jīng)元損傷及GluR2表達(dá)變化的分析,選擇上述研究?jī)?nèi)容變化相對(duì)最明顯的SE后某時(shí)間點(diǎn)大鼠進(jìn)行免疫共沉淀。2.SE模型制備及入組標(biāo)準(zhǔn)：Wistar大鼠腹腔注射氯化鋰,18-24 h后腹腔注射鹽酸匹羅卡品誘發(fā)癲癇發(fā)作,出現(xiàn)SE后60-90 min,腹腔注射地西泮解除抽搐。癇性發(fā)作行為學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為5級(jí),其中4級(jí)和5級(jí)為全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作。誘發(fā)成功即出現(xiàn)4級(jí)以上發(fā)作行為。3.組織病理學(xué)取材：正常大鼠以及成功誘導(dǎo)SE發(fā)作后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠分批處死,每組隨機(jī)選擇6只進(jìn)行心臟灌流。10%水合氯醛麻醉大鼠后進(jìn)行心臟灌流、固定、脫水、透明、石蠟包埋,石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,進(jìn)行Nissl染色及TUNEL染色觀察海馬CA1、CA3區(qū)形態(tài)學(xué)變化以及凋亡情況。4.Nissl染色：將已制備好的各組石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,37℃水浴箱中以0.5%硫瑾孵育10 min,95%乙醇分化至背景無色,常規(guī)脫水、透明、封片。每隔5張冠狀海馬切片取1個(gè),共取3個(gè)染色。染色結(jié)果在×400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)CA1區(qū)、CA3區(qū)100μm × 100μm區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)量。5.TUNEL染色：取已制備好的各組石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,去除內(nèi)源性過氧化物酶,蛋白酶K通透處理。TUNEL1號(hào)2號(hào)混合液37℃反應(yīng)1 h,陰性對(duì)照組用PBS代替1號(hào)液,其他相同。PBS清洗后加50 ul TUNEL 3號(hào)液37℃濕盒孵育30 min. PBS清洗,DAB顯色,蘇木精復(fù)染。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)中使用的是與Nissl染色相鄰的海馬切片,染色后胞核可見棕黃色顆粒,此為陽(yáng)性細(xì)胞。光鏡下分析染色結(jié)果,每組各選CA1、CA3區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞最明顯的3個(gè)×400高倍視野,計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取平均值。6.Western blot:正常及SE后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠麻醉去除顱骨,快速于冰袋中取海馬,提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育,二抗孵育。以β-action為內(nèi)參調(diào)節(jié)上樣誤差,以目的蛋白(GluR2)／內(nèi)參蛋白(β-action)的灰度值作為檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。7.免疫共沉淀：正常及SE后72 h大鼠同時(shí)在冰上快速取海馬,提取蛋白,Protein A/G plus agarose去除非特異性結(jié)合蛋白。目的蛋白抗體及對(duì)照抗體孵育裂解蛋白,離心去掉非目的蛋白,進(jìn)行Western blot步驟,將SE組中GAPDH與GluR2的灰度值之比與對(duì)照組中GAPDH與GluR2的灰度值之比進(jìn)行比較,得出GAPDH/GluR2的耦合變化。8.統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 17.0軟件,計(jì)量資料采用x±s表示,兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗(yàn),各組數(shù)據(jù)間的差異采用單因素方差分析。結(jié)果1.SE發(fā)生后各時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著減少,與對(duì)照組存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.SE發(fā)生后24 h開始凋亡細(xì)胞數(shù)量增加,到72 h凋亡達(dá)到最高點(diǎn),且各組與對(duì)照組凋亡神經(jīng)元數(shù)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3.SE發(fā)生后24 h、72 h、7dGluR2相對(duì)表達(dá)量減少,且SE后72 h GluR2減少最明顯,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.與對(duì)照組比較,SE發(fā)生后72 h時(shí)GluR2/GAPDH蛋白復(fù)合物耦合增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.SE可導(dǎo)致海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元損傷。2.海馬GluR2表達(dá)降低及GluR2/GAPDH蛋白復(fù)合物耦合增加可能是癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠神經(jīng)元損傷的機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：癲癇持續(xù)狀態(tài) 海馬 α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸受體 甘油醛-3-磷酸脫氫酶
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742.1;R-332
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號(hào)說明13-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-27
• 結(jié)果27-29
• 討論29-32
• 結(jié)論32-33
• 附圖表33-39
• 參考文獻(xiàn)39-44
• 綜述44-55
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 致謝55-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文56-57
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表57

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本文編號(hào)：544505